Cell?| 細(xì)胞外基質(zhì)感知調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的自噬異質(zhì)性

撰文 |咸姐

自噬是細(xì)胞通過(guò)降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)維持代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵生理過(guò)程，在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。然而，腫瘤細(xì)胞自噬水平的調(diào)控機(jī)制遠(yuǎn)比傳統(tǒng)認(rèn)知更為復(fù)雜——除營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和能量感應(yīng)等經(jīng)典途徑外，腫瘤微環(huán)境中的物理化學(xué)因素，尤其是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）如何參與自噬調(diào)控，長(zhǎng)期以來(lái)缺乏系統(tǒng)性研究。PDA因其極高的惡性程度和治療抵抗性，成為癌癥研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。值得注意的是，PDA具有顯著的纖維化特征，其微環(huán)境中富含層粘連蛋白、膠原蛋白等ECM成分，這些基質(zhì)成分不僅構(gòu)成腫瘤的結(jié)構(gòu)支架，更通過(guò)機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)深刻影響腫瘤細(xì)胞行為，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)【1,2】。近年來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序和空間組學(xué)技術(shù)揭示了腫瘤內(nèi)部存在顯著的功能異質(zhì)性：不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞在增殖能力、代謝狀態(tài)和藥物敏感性方面呈現(xiàn)高度多樣性。在PDA中，這種異質(zhì)性與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，但其分子基礎(chǔ)尚不完全清楚。自噬作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)微環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)性機(jī)制，其活性水平在腫瘤內(nèi)部分布不均——部分細(xì)胞維持高自噬通量以增強(qiáng)化療耐受性，而另一些細(xì)胞則降低自噬活性以優(yōu)先進(jìn)行增殖【3】。這種“自噬異質(zhì)性”如何產(chǎn)生、如何被微環(huán)境信號(hào)所調(diào)控，成為理解PDA生物學(xué)和開(kāi)發(fā)治療策略的關(guān)鍵問(wèn)題。

近日，來(lái)自美國(guó)紐約大學(xué)朗格尼健康中心的Alec C. Kimmelman團(tuán)隊(duì) 在Cell上在線發(fā)表題為Extracellular matrix sensing regulates intratumoral heterogeneity of autophagic flux的文章，發(fā)現(xiàn)PDA細(xì)胞能夠選擇性感知關(guān)鍵的ECM成分，從而獨(dú)立于經(jīng)典的能量應(yīng)激相關(guān)通路，控制其胞內(nèi)自噬水平，從而獲得協(xié)調(diào)增殖、存活及化療響應(yīng)能力。ECM感知通過(guò)整合素α3-Hippo-YAP1信號(hào)軸精細(xì)調(diào)控自噬水平，靶向該信號(hào)軸可有效抑制PDA生長(zhǎng)，并提高其對(duì)FDA批準(zhǔn)療法的敏感性。總之，本研究揭示了PDA中通過(guò)ECM感知調(diào)控自噬的新機(jī)制，并在多種臨床前模型及患者標(biāo)本中闡明了其生物學(xué)意義。

為系統(tǒng)解析PDA細(xì)胞自噬通量的異質(zhì)性特征，本文研究人員首先利用穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3-RFP（GLR）雙熒光報(bào)告基因的人源PDA定PDA球體中自噬通量的正向調(diào)控因子。通過(guò)比較2D營(yíng)養(yǎng)饑餓與3D培養(yǎng)條件下的篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一類3D培養(yǎng)特異性的自噬調(diào)控基因，其中多個(gè)Hippo信號(hào)通路的上游組分（如NF2、MST1/2和LATS1/2）被鑒定為關(guān)鍵候選分子。NF2或MAP4K4缺失可顯著降低球體中的自噬水平，而補(bǔ)充野生型NF2則能恢復(fù)自噬水平。機(jī)制分析顯示，PDA細(xì)胞中Hippo上游信號(hào)存在NF2-MAP4K4依賴和WWC1-MST1/2依賴兩個(gè)并行模塊，二者均通過(guò)激活LATS1/2激酶抑制下游效應(yīng)因子YAP1活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的調(diào)控，其中約50%低表達(dá)MST1/2的PDA細(xì)胞系選擇性依賴NF2模塊調(diào)控自噬。

深入探究上游Hippo信號(hào)調(diào)控自噬的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，敲除NF2的PDA細(xì)胞中溶酶體直徑顯著減小，提示溶酶體形態(tài)和功能發(fā)生改變。此外，NF2缺失導(dǎo)致溶酶體酸化和溶酶體相關(guān)膜蛋白表達(dá)水平下降，Cathepsin D活性降低，同時(shí)自噬底物p62和LC3-II堆積，表明NF2缺失造成溶酶體生物發(fā)生與功能雙重障礙。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）發(fā)現(xiàn)YAP1直接結(jié)合于CTSD、TFEB、LAMP1等多個(gè)自噬/溶酶體基因的調(diào)控區(qū)域，RNA測(cè)序證實(shí)NF2敲除后這些基因mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，且70%的下調(diào)基因?yàn)閅AP1直接結(jié)合靶點(diǎn)。

與此同時(shí)，研究人員又通過(guò)CRISPR-Cas9篩選策略鑒定PDA球體中自噬通量的負(fù)向調(diào)控因子，結(jié)果顯示下游Hippo效應(yīng)分子YAP1、TEAD4及NCOR共抑制復(fù)合物多個(gè)組分（NCOR1、HDAC3、GPS2、TBL1XR1）特異性富集為3D條件下的自噬負(fù)調(diào)控因子。過(guò)表達(dá)組成型激活的YAP1-S6A突變體或野生型YAP1均可模擬NF2缺失的表型，顯著降低自噬通量、減少自噬異質(zhì)性，并下調(diào)自噬/溶酶體基因表達(dá)。機(jī)制研究揭示，NF2缺失或YAP1激活導(dǎo)致自噬/溶酶體基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27乙酰化水平降低，該表觀遺傳改變可通過(guò)NCOR1敲除予以恢復(fù)；免疫共沉淀證實(shí)YAP1與NCOR1、HDAC3、TEAD4相互作用，且在NF2缺失時(shí)結(jié)合增強(qiáng)。單敲除實(shí)驗(yàn)表明YAP1、NCOR1、HDAC3及TEAD4（非TEAD1/3）可恢復(fù)NF2缺失細(xì)胞的自噬功能，且該調(diào)控不依賴mTOR、AMPK及氨基酸感應(yīng)通路。

進(jìn)一步地評(píng)估Hippo-YAP調(diào)控自噬對(duì)PDA細(xì)胞適應(yīng)性及腫瘤生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)NF2缺失細(xì)胞在2D培養(yǎng)中存活正常，但在3D球體中顯著死亡，該表型在約40%高表達(dá)NF2且低表達(dá)MST1/2的PDA細(xì)胞系中重現(xiàn)，提示存在NF2依賴型和非依賴型兩類PDA細(xì)胞。小鼠原位胰腺癌移植模型顯示，NF2敲除顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且抑制效應(yīng)強(qiáng)于ATG5敲除，提示同時(shí)阻斷自噬通量和溶酶體功能造成更嚴(yán)重的適應(yīng)性障礙。共移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF2敲除或YAP1激活細(xì)胞在腫瘤內(nèi)自噬通量及異質(zhì)性顯著降低。單細(xì)胞測(cè)序分析臨床PDA患者腫瘤原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高YAP活性與低自噬水平呈顯著負(fù)相關(guān)，驗(yàn)證了該調(diào)控機(jī)制的患者相關(guān)性。

PDA患者原發(fā)腫瘤切片的免疫標(biāo)記顯示，與遠(yuǎn)離基質(zhì)的腫瘤細(xì)胞相比，靠近基質(zhì)αSMA陽(yáng)性細(xì)胞（0-25 μm）的腫瘤細(xì)胞（CK19+）表現(xiàn)出更高的YAP1核轉(zhuǎn)位水平。為了驗(yàn)證這一觀察結(jié)果，研究人員通過(guò)體外基質(zhì)樣HPSC共培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)證實(shí)基質(zhì)來(lái)源ECM通過(guò)Hippo通路抑制自噬，該效應(yīng)可被活性膠原酶消除或NF2缺失阻斷。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)顯示PDA細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合層粘連蛋白（Lam）而非纖連蛋白或玻連蛋白，Matrigel（富含Lam）3D培養(yǎng)可劑量依賴性激活YAP1并抑制自噬，該效應(yīng)在NF2缺失細(xì)胞中消失，證實(shí)Lam感知通過(guò)NF2-Hippo-YAP軸發(fā)揮作用。篩選不同Lam亞型發(fā)現(xiàn)，含α1β1γ1（Lam-111）或α5β1γ1（Lam-511）的三聚體可激活YAP1并抑制自噬，而α4β1γ1（Lam-411）無(wú)此效應(yīng)，提示特定Lam鏈組合的功能特異性。原位瘤空間分析顯示低自噬細(xì)胞更接近Lam且YAP1激活更高，RNA-seq和患者scRNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)低自噬-高YAP細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，形成更大腫瘤，且該增殖優(yōu)勢(shì)依賴于Lam感知。這些臨床前及臨床研究結(jié)果表明，通過(guò)Hippo-YAP1信號(hào)通路感知Lam，可在轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)PDA在活躍增殖與自噬性生存之間的應(yīng)答轉(zhuǎn)換。

通過(guò)人整合素（ITG）芯片與流式細(xì)胞術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，PDA細(xì)胞高表達(dá)ITGA2、ITGA3、ITGAV等多種整合素，但僅敲低ITGA3可顯著增加自噬通量水平，降低自噬異質(zhì)性，并部分削弱細(xì)胞對(duì)Lam的黏附，而且ITGA3敲低可上調(diào)自噬/溶酶體基因表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Hippo-YAP1靶基因。進(jìn)一步地，ITGA3缺失不影響mTOR/AMPK通路，但導(dǎo)致p-LATS1磷酸化升高、YAP1蛋白穩(wěn)定性下降。敲低NF2/LATS1/2或蛋白酶體抑制可恢復(fù)YAP1蛋白水平，提示ITGA3缺失加速YAP1經(jīng)泛素-蛋白酶體降解，而且同時(shí)敲低LATS1/2可逆轉(zhuǎn)ITGA3缺失誘導(dǎo)的自噬通量升高和YAP1活性降低。這些發(fā)現(xiàn)表明ITGA3可通過(guò)Hippo通路發(fā)出信號(hào)來(lái)控制YAP 1活性和自噬通量。

羥氯喹作為氯喹的低毒性代謝產(chǎn)物，是唯一獲FDA批準(zhǔn)用于阻斷患者自噬通量的藥物，但其作為單藥療效有限。鑒于ITGA3在PDA中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)，研究人員體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ITGA3敲低可增強(qiáng)PDA細(xì)胞對(duì)氯喹的敏感性。患者來(lái)源類器官中，ITGA3中和抗體或基因敲除聯(lián)合氯喹亦可產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。原位移植瘤模型中，ITGA3敲除顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，聯(lián)合氯喹或吉西他濱進(jìn)一步增強(qiáng)了抑瘤效果。通過(guò)共移植實(shí)驗(yàn)策略，將BFP標(biāo)記的對(duì)照和ITGA3敲除細(xì)胞混合植入小鼠胰腺，流式分析顯示ITGA3敲除使腫瘤自噬通量整體升高且異質(zhì)性降低，并消除了吉西他濱誘導(dǎo)的自噬高細(xì)胞富集。患者單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析顯示，化療后腫瘤上皮細(xì)胞中高自噬特征細(xì)胞比例顯著增加，提示化療誘導(dǎo)自噬高細(xì)胞富集。ITGA3敲除聯(lián)合氯喹或吉西他濱可顯著降低原位腫瘤重量，聯(lián)合治療組cleaved caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞比例最高。總體而言，靶向ECM介導(dǎo)的自噬水平調(diào)控，可用于提高PDA對(duì)FDA批準(zhǔn)療法的敏感性。

綜上所述，本研究揭示了PDA中ECM感知調(diào)控自噬異質(zhì)性的新機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ECM中的Lam通過(guò)整合素α3-Hippo-YAP1信號(hào)軸精細(xì)調(diào)控自噬水平，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)呈現(xiàn)低自噬（高增殖）和高自噬（化療耐受）兩種功能迥異的細(xì)胞亞群。靶向ITGA3可消除自噬異質(zhì)性，增強(qiáng)氯喹和吉西他濱的療效，為克服PDA治療抵抗提供了新的聯(lián)合治療策略。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.053

參考文獻(xiàn)

1. Tian, C., Clauser, K.R., O¨ h lund, D., et al. (2019). Proteomic analyses of ECM during pancreatic ductal adenocarcinoma progression reveal different contributions by tumor and stromal cells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA116, 19609–19618.

2. Shi, S., Luo, Y., Wang, M., et al. (2022). Tumor fibrosis correlates with the survival of patients with pancreatic adenocarcinoma and is predictable using.e18.

制版人： 十一

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