基因修飾T細胞治療產品藥理毒理研究關鍵考量點及案例分析

基因修飾T細胞治療如CAR-T和TCR-T細胞治療，在多個血液瘤適應癥中顯示出不錯的藥效。細胞產品的非臨床安評與傳統化藥、生物藥不同，HESI和美國FDA共同出臺了一些文件，國內CDE也有相應指導原則，對T細胞治療產品的非臨床安評提供了建議。

FDA已經批準了7款CAR-T產品上市，包括5款CD19 CAR-T，分別是KiTe的YESCARTA（2017）、TECARTUS（2020），Celgene的BREYANZI（2021），諾華的KYMRIAH（2017），Autolus Therapeutics的Aucatzyl（2024）；2款BCMA CAR-T，分別是BMS的ABECMA（2021）、傳奇生物/強生的CARVYKTI（2022）。

基因修飾T細胞治療產品主要安全性風險包括細胞因子釋放綜合征、神經毒性、on-target/off-tumor作用，脫靶毒性。另外，通過病毒載體轉染T細胞理論上會產生外源基因整合相關的基因組損傷，如基因編輯脫靶風險、載體插入突變風險、載體重組風險等。體內研究方面，監管機構不鼓勵在非相關動物模型中開展研究。但由于細胞治療產品的特性，傳統的標準動物毒理研究并不適用。所以這類基因修飾T細胞治療非臨床安評的核心聚焦在評估靶點的表達，如on-target/off-tumor作用及為排除脫靶毒性而開展的特異性測試。這些研究高度依賴in silico和in vitro tools。還有一項重要研究工作是整合位點分析，評估插入突變等風險。

1、靶點表達及可靠性測定

T細胞治療的核心是識別腫瘤細胞表面的目標抗原，即使豐度比較低的抗原表達，T細胞也能有效殺傷。這種高活性、高靈敏度的免疫反應，對靶點的要求很高，以保障最大化產生藥效的同時，最小化off-tumor和off-target的風險。

On-target/off-tumor：這點比較容易理解，僅在腫瘤細胞表面表達的靶點少之又少，大部分可用靶點的特點是腫瘤表面高表達，正常組織低表達。所以CAR-T細胞治療的一部分毒性來自于對表達該靶點的正常組織的殺傷。這就需要對目標靶點的表達進行研究。比如Kite Pharma/Gilead的CD19 CAR-T產品YESCARTA開展了CD19在正常及惡性B細胞系腫瘤細胞中的表達研究、Juno/BMS的CD19 CAR-T產品BREYANZI也用生物信息學技術研究了CD19在正常及惡性B細胞瘤的分布。BMS的BCMA CAR-T產品ABECMA研究了人腫瘤細胞系、腫瘤組織的BCMA表達情況，發現超過41%人多發性骨髓瘤樣品高表達BCMA（≥50%細胞陽性）。淋巴瘤樣本中表達則弱很多，以>30%設限，無樣本表達BCMA。最后，由于CAR-T產品有入腦趨勢，具備引發神經毒性的可能性，靶蛋白在腦部組織的表達應進行研究。

評價方法：首先，可以利用生物信息學/in silico方法，富集目標靶點在健康、疾病組織中的表達數據，proteinatlas.org，gtexportal.org，the Cancer Genome Atlas [TCGA]等網站或數據庫可以幫助實現這一目的。其次，只有干實驗是不充分的，還要考慮“濕數據”。可以考慮采用ISH、IHC、FACS等方法檢測目標靶點在真實健康、疾病樣本中的表達和分布情況。這里對檢測方法的要求很高，需要對組織樣本來源和質量、對照設置、試劑來源和質量、質控等給予足夠重視，保障實驗結果的真實、客觀、可靠。以上比較，適用于CAR-T類產品。對于TCR-T，由于識別的主要是MHC-Ⅰ遞呈的多肽抗原，需要對多肽序列進行基因組blast比對，評估潛在的on-target/off-tumor風險。另外，對多肽-MHC的在相關細胞或組織中的表達情況也需要進行檢測。

Off-target：雖然CAR-T的CAR和TCR-T的TCR特異性不錯，但由于這類細胞治療產品的高活性，還是要充分表征潛在的脫靶風險，評估是否有其它內源性靶點的結合。畢竟，即使中等或弱結合，也會出現不容忽視的毒性。比如，Juno/BMS的CD19 CAR-T產品BREYANZI就考察了CAR與CD19的親和力及特異性。

評價方法：對于TCR-T產品，可以先通過丙氨酸掃描等方法確定多肽中的TCR核心識別區域。然后采用生物信息學方法鑒定多肽的同源蛋白，即潛在脫靶結合對象。另外，也要排除對不同HLA表型呈遞的不相關肽的識別。這點可以采用EBV轉染的B細胞進行驗證。當然，以上是基于蛋白結合的方法，如果能采用功能性測試，如細胞毒性，作為終點進行考察，說服力會更強。對于CAR-T產品，CAR的結構主要是scFv抗體，可以采用抗體的評估特異性的方法和技術，比較常規，不再贅述。

2、體內安全性和活性評價模型

對于化藥、生物藥、寡核苷酸、溶瘤病毒、疫苗等產品，動物毒理研究在非臨床安評中發揮著關鍵性作用。但是，對于基因修飾的T細胞治療產品，動物毒理研究則面臨著挑戰。主要包括：1）對動物靶點的識別存在缺陷，比如CAR-T產品中的CAR可能與動物無交叉結合，TCR-T由于HLA限制性，更是無法與動物種屬中對應的多肽/MHC結合；2）人源細胞進入動物后會出現移植物抗宿主、宿主抗移植物的雙向作用；3）采用自體動物替代細胞的技術可行性問題。基于此，即使CAR-T可以識別食蟹猴中的同靶點，也無法實現在該種屬中毒理評價的目的。

既然健康動物不適用，模型動物自然就“備胎”轉正，派上用場了。傳統腫瘤藥物，荷瘤鼠模型主要用于藥效評價，伴隨粗略看下安全性指標如體重、死亡情況等。對于基因修飾細胞治療產品，動物模型在安全性評價中正兒八經占了“C位”。常用的是采用嚴重免疫缺陷動物，異源移植不同腫瘤模型，既可評估藥效，也可用于組織分布，還能用于安全性評價，“一箭三雕”。

當然，動物模型用于安評是存在一些局限性的：1）解決了宿主抗移植物作用，未解決移植物抗宿主反應；2）因缺少髓系細胞，T細胞治療產品引起的細胞因子釋放、神經毒性預測不足，而這些都是這類產品臨床常見不良反應；3）不同種屬之間蛋白靶點的同源性差異、表達水平差異、分布差異等決定了動物模型用于on-target/off-tumor和off-target評估方面也需要case by case分析。

3、病毒和非病毒基因遞送系統的安全性

這點主要跟基因組損傷風險有關。病毒載體通過將RNA轉換為DNA，并整合到靶細胞染色體中，穩定表達。慢病毒載體是常用載體之一。慢病毒載體的潛在擔憂是生產過程中或患者給藥后產生具備可復制能力的慢病毒（replication-competent lentivirus, RCL）或插入突變引發的致癌性風險。當然，成熟T細胞病毒轉染后的癌變風險比造血干細胞是要低的。現有臨床研究也未見明確的慢病毒載體與致癌突變間的高風險關聯，未見基因修飾T細胞治療產品成瘤報道。而且，第三代慢病毒載體用self-inactivating 3’ long-term-repeat (LTR) 替代了之前的active LTR，進一步降低了癌變風險。

不過，目前的基因修飾T細胞治療的發展趨勢具備開發活性更強、作用更持久、更有效針對實體瘤、同種異體使用等特點。其中，采用核酸酶去敲除特定基因如負調控基因，或通過基因編輯增強整合實現表達或功能增強。常用的基因編輯系統包括Zinc Finger Nucleases (ZFNs), CRISPR, TALENs, MegaTALS等。基因編輯有一定的脫靶率，導致細胞出現新的功能、基因缺失、易位、遺傳毒性及成瘤性，需要謹慎評估引入的這些風險。

通過體內動物試驗評估T細胞治療的致瘤性不太現實。體外試驗可以通過考察不加細胞因子如IL-2情況下，基因修飾T細胞產品的增殖情況，判斷成瘤風險。不過，對于改造后本身增殖能力得以增強，且不依賴細胞因子的產品，不太適用。嚴格講，對于這類產品的成瘤風險評估的實驗手段是缺乏的。

4、監管考量

EMA、FDA及NMPA針對基因治療產品均有指導原則發布，前面文章列過詳細清單，不再贅述。不過特異性針對基因修飾T細胞治療產品尚無各國統一的指南。可以參考已經獲批上市的7款CAR-T產品的臨床前研究資料。迄今為止，尚無基因修飾T細胞治療產品開展非人靈長類毒性研究。各國監管機構普遍認為，傳統動物體內毒理研究并不適用于這類產品。PMDA更是認為伴隨模型動物做些臨床觀察就夠了。但還有一點被普遍認同，用于檢測on-target/off-tumor毒性、off-target/off-tumor毒性、不可控增殖、成瘤性（如核型分析）等體外試驗是非常有價值的。

對于iPSC來源的T細胞治療產品，PMDA明確建議需要評估成瘤風險。NMPA則要求在首次臨床試驗前完成致瘤性試驗。

由于基因修飾T細胞產品太新，全球獲批的數量很少，而且這類產品技術更新非常快，無論對于工業界還是監管機構，所積累的背景數據和經驗都是不足的。所以，需要充分與監管機構進行溝通、討論，確定開發策略和方案。

5、案例

下文總結了FDA批準上市的4款CD19和1款BCMA CAR-T產品的非臨床研究內容。主要研究內容聚焦藥理學、藥代動力學相關。毒理學研究開展的內容很少，以伴隨藥效模型考察為主。另外，整合位點分析通常是需要開展的。首先看下4款CD19 CAR-T產品的資料。

再看下1款BCMA CAR-T產品ABECMA的資料。2021年3月26日，FDA批準了首個針對晚期多發性骨髓瘤患者的個性化細胞療法，即百時美施貴寶公司的ABECMA，用于治療對至少四種不同類型的既往治療方法沒有應答或者治療后復發的多發性骨髓瘤患者。年治療費用約419600美元。多發性骨髓瘤是一種罕見的血癌，異常漿細胞在骨髓中累積并在人體許多骨骼中形成腫瘤，使骨髓無法產生足夠的健康血細胞，從而導致低血細胞計數。

ABECMA是一種B細胞成熟抗原（BCMA）靶向的基因修飾自體嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法。患者的T細胞被收集并進行基因改造，使其包含有助于靶向和殺死骨髓瘤細胞的新基因，修飾后的細胞重新注入患者體內。對ABECMA的臨床前開發內容總結如下。

總結

基因修飾T細胞治療產品的臨床前安全性評價手段是受限的。目前的研究主要還是以體外手段為主，重點考察on target/off-tumor和off-target的風險，及可能的致瘤風險。伴隨模型動物開展毒理測試實屬無奈之舉，可以提供一些信息。安全性評價除了用于提示臨床風險外，還用于臨床起始劑量計算。但與化藥、生物藥不同，細胞治療產品是活的藥物，臨床遇到靶點蛋白后，會進一步激活、擴增，傳統基于臨床前劑量折算臨床起始劑量的方法并不適用。更多的還是參考同類產品的劑量，并結合臨床前數據對該劑量的風險進行評估。