AAV和LV基因療法的致突變和致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

在過去的幾年中，F(xiàn)DA和EMA批準(zhǔn)了多種基因治療(Gene Therapy, GT)藥物。ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上顯示有1000多基因治療臨床試驗(yàn)項(xiàng)目正在進(jìn)行，覆蓋從腫瘤到隱性遺傳病等多個(gè)適應(yīng)癥。基因治療通常會(huì)使用病毒載體遞送，可能存在一些安全問題，比如插入性突變的風(fēng)險(xiǎn)。監(jiān)管機(jī)構(gòu)建議對(duì)基于病毒載體的基因治療產(chǎn)品進(jìn)行插入性突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

美國毒理學(xué)學(xué)院第43屆年會(huì)中圍繞如何應(yīng)對(duì)基因治療領(lǐng)域不斷出現(xiàn)的挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論。會(huì)議全面回顧了重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）和慢病毒載體（LV）相關(guān)的致突變性和致癌性風(fēng)險(xiǎn)的歷史和當(dāng)前認(rèn)知，并通過使用rAAV和LV作為案例，展示了如何在藥物開發(fā)過程中評(píng)估這種風(fēng)險(xiǎn)。本文略作分享。

當(dāng)病毒載體意外整合到基因組中時(shí)，可能會(huì)發(fā)生載體介導(dǎo)的遺傳毒性，并可能會(huì)激活原癌基因，和/或?qū)е虏迦胄酝蛔儯M(jìn)而可能破壞或失調(diào)基因表達(dá)，引發(fā)克隆擴(kuò)增和腫瘤形成。如下圖所示。載體整合到基因組中涉及病毒和非病毒因素。病毒因素包括載體設(shè)計(jì)（是否存在強(qiáng)增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子序列、是否存在剪接供體或受體位點(diǎn)以及有利于替代轉(zhuǎn)錄本生成的聚腺苷酸化信號(hào)）以及宿主整合位點(diǎn)（IS）或插入位點(diǎn)特征。非病毒因素包括轉(zhuǎn)基因功能、靶細(xì)胞、疾病狀態(tài)、年齡以及表觀遺傳因素等。

AAV遺傳毒性、整合和成瘤風(fēng)險(xiǎn)

AAV于1965年被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是非致病性的。天然存在的AAV的組織嗜性取決于AAV的血清型。到目前為止，已鑒定出13種AAV（AAV1-AAV13）血清型。全球超過80%的人群對(duì)AAV呈陽性反應(yīng)，AAV基因組在人類腫瘤和正常組織中均有發(fā)現(xiàn)，但缺乏克隆性。在20世紀(jì)90年代初，野生型AAV被發(fā)現(xiàn)具有高傾向整合到人類19號(hào)染色體的AAVS1位點(diǎn)。近年來，rAAV已被用于基因遞送，目前已有九種相關(guān)產(chǎn)品獲批。最近獲批的AAV基因治療藥物是Kebilidi，于2024年獲批。rAAV的整合較為罕見，主要是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈Σ《据d體中用于復(fù)制的Rep區(qū)域。然而，在人類中，當(dāng)整合發(fā)生時(shí)，通常出現(xiàn)在染色體17和19的熱點(diǎn)區(qū)域（hotspots），如CpG島或核糖體DNA重復(fù)序列附近。

在小鼠中，rAAV傾向于插入基因調(diào)控元件、熱點(diǎn)區(qū)域或癌基因附近。在一系列針對(duì)黏多糖貯積癥VII型（MPSVII）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC）缺乏癥、桑德霍夫病或甲基丙二酸血癥的小鼠模型的研究中，新生小鼠接受治療后，13-24個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)了劑量依賴性的肝細(xì)胞癌（HCC），主要由于它們對(duì)rAAV整合和腫瘤生成的敏感性。這些研究還表明，在易患腫瘤的小鼠品系中，載體設(shè)計(jì)中的特定成分、載體DNA相關(guān)污染物等可能會(huì)增加載體整合和腫瘤生成的風(fēng)險(xiǎn)。在小鼠中，rAAV的整合主要發(fā)生在Rian位點(diǎn)內(nèi)的Mir341。由于人類不攜帶Rian位點(diǎn)，因此rAAV在小鼠Rian位點(diǎn)整合導(dǎo)致的HCC與人體相關(guān)性尚不明確。

有趣的是，在接受rAAV基因治療的大動(dòng)物中，尤其是接受單次基因治療的B型血友病和A型血友病犬（觀察期為8-10年），以及接受rAAV1、5或8基因治療的非人靈長類動(dòng)物（觀察期為1-5年），并未報(bào)告HCC的發(fā)生。在單次接受AAV基因治療的血友病犬中，觀察到肝臟中有超過1700個(gè)整合位點(diǎn)，且在五只犬中發(fā)現(xiàn)了靠近細(xì)胞生長相關(guān)基因的擴(kuò)增細(xì)胞克隆，但未出現(xiàn)肝結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn)化。

目前，許多rAAV基因治療藥物正處于臨床試驗(yàn)的不同階段，其中大多數(shù)處于I/II期。用于基因遞送的最常用AAV血清型是AAV2，其次是AAV8、AAV9和AAV1。目前為止，尚未在臨床試驗(yàn)或已上市藥物中檢測到與rAAV基因治療相關(guān)的遺傳毒性。

需要明確的是，接受AAV基因治療的患者中確實(shí)有HCC的發(fā)生，尤其是肝臟靶向治療。這些患者發(fā)生HCC的主要原因包括：1）既往有病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（HCV）或人類免疫缺陷病毒（HIV）病史；2）存在晚期肝纖維化或早期肝硬化；3）野生型AAV2在癌基因中的整合。需要注意的是，目前尚不清楚缺乏Rep的rAAV基因治療載體是否會(huì)在人肝細(xì)胞中整合到癌基因中。AAV在人類基因組中的整合位點(diǎn)可能與小鼠基因組中的整合位點(diǎn)不同。總之，AAV與人類HCC風(fēng)險(xiǎn)增加之間的關(guān)系存在較大爭議，持反對(duì)意見的認(rèn)為AAV的存在僅僅是相關(guān)性而非因果關(guān)系。

LV遺傳毒性、整合和成瘤風(fēng)險(xiǎn)

LVs是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RVs）的重組形式。40多年來，RVs已被廣泛用于基因治療，主要用于單基因疾病、癌癥和傳染病。RVs能夠提供穩(wěn)定（長期）且高效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，第一代用于基因治療的RVs因插入性突變導(dǎo)致的不良事件而受到關(guān)注。從2003年到2011年，RV遞送的基因治療被證明會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、染色體異常和致癌事件，包括骨髓增生異常綜合征和白血病，主要是由于插入導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的改變。

2007年，研究發(fā)現(xiàn)RVs的共同插入位點(diǎn)（CIS）主要集中在特定區(qū)域，尤其是靠近MDS-EVI1、PRDM16、LMO2和CCNE2基因位點(diǎn)，但并非所有插入位點(diǎn)都與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。此外，CIS主要出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域。隨后，為了克服早期RVs的安全性問題，研究人員開發(fā)了安全表現(xiàn)更好的RVs，例如改良的LVs。與其他僅能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞的RVs不同，LVs可以轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞，同時(shí)仍能提供穩(wěn)定（長期）且高效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。

目前，LVs主要用于體外細(xì)胞修飾，以生成用于細(xì)胞治療的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞。LVs源自HIV，但它們是復(fù)制缺陷型的，并且經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)從第一代、第二代進(jìn)化到第三代，遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)更低。第一代LVs由于在構(gòu)建中包含gag、pol和調(diào)控輔助蛋白（vif、vpr、vpu和nef），并且這些蛋白受細(xì)胞巨化病毒（CMV）啟動(dòng)子的調(diào)控，因此具有較高的整合風(fēng)險(xiǎn)。第二代和第三代LVs的整合風(fēng)險(xiǎn)較低，因?yàn)檎{(diào)控元件已去除。其中，第三代LVs也被稱為自滅活LVs（SIN LVs），缺乏導(dǎo)致較高遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的LTR區(qū)域中的增強(qiáng)-啟動(dòng)子元件。盡管如此，由于LVs可能意外生成具備復(fù)制能力的病毒，以及非隨機(jī)基因組整合，LVs仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

LVs的整合和遺傳毒性機(jī)制包括跨轉(zhuǎn)錄基因整合，主要在內(nèi)含子中。SIN LVs可以通過以下方式導(dǎo)致遺傳毒性：1）當(dāng)它們?cè)趦?nèi)部位置攜帶強(qiáng)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列時(shí)，上調(diào)插入位點(diǎn)（IS）周圍基因的表達(dá)；2）誘導(dǎo)異常剪接和/或靶基因內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的提前終止，可能導(dǎo)致功能喪失或功能獲得性突變。

為了克服新一代LVs的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，目前正在開發(fā)非整合型LVs（NILVs）。NILVs旨在用于疫苗接種、癌癥治療、定點(diǎn)基因插入、基因破壞策略等。它們是通過在pol的整合酶區(qū)域引入突變生成的，這些突變分為I類或II類。I類突變阻止整合酶活性、基因組DNA結(jié)合和載體DNA結(jié)合，以及LVs整合酶的多聚化。II類突變不僅損害整合，還影響許多其他病毒生命周期。I類突變更適合用于生成NILVs。盡管NILVs被設(shè)計(jì)為非整合型，至少不能通過整合酶機(jī)制，但還是存在一些非整合酶依賴的整合，通常發(fā)生在染色體斷裂位點(diǎn)，通過非同源末端連接（NHEJ）介導(dǎo)。潛在解決方案包括抑制雙鏈斷裂修復(fù)途徑中的細(xì)胞因子，或限制比超螺旋DNA整合效率更高的線性載體DNA。

迄今為止，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)了13種慢病毒載體細(xì)胞療法，其中最新的一種是TECELRA?，這是首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)用于實(shí)體瘤治療的細(xì)胞療法。截至2024年11月，所有FDA批準(zhǔn)的LV修飾細(xì)胞療法中，只有SKYSONA（用于治療腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[CALD]）與人類的插入性突變相關(guān)。SKYSONA（Elivaldogene autotemcel或Eli-cel）是一種自體體外修飾細(xì)胞療法，使用lenti-D LV將攜帶ABCD1基因的cDNA添加到患者自身的CD34+造血干細(xì)胞中，然后將修飾后的細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進(jìn)行治療。在SKYSONA的臨床試驗(yàn)中，67名患者中有3人在治療后5年內(nèi)發(fā)展為造血惡性腫瘤，所有3例均為Lenti-D LV介導(dǎo)的插入性癌變。

在2022年FDA咨詢委員會(huì)會(huì)議上，與Bluebird bio和細(xì)胞治療領(lǐng)域的專家討論了SKYSONA的致癌機(jī)制，認(rèn)為其與位于ABCD1 cDNA上游內(nèi)部位置的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子MNDU3有關(guān)，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所有造血譜系的高水平基因表達(dá)。整合主要發(fā)生在MECOM基因附近，這是一個(gè)已知的髓系癌基因，在54名接受治療的患者中，有53名發(fā)生了整合。其他插入位點(diǎn)包括PRDM16、MPL和MIR100HG。

CALD是一種進(jìn)行性、不可逆且致命的神經(jīng)退行性疾病，主要影響年幼男孩。SKYSONA在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出非常高的有效性，約87%的治療患者在長達(dá)7年內(nèi)保持無事件生存，與早期活動(dòng)性CALD的未治療患者相比，CALD相關(guān)事件減少了72%，大多數(shù)患者保持基線神經(jīng)功能和正常智商。SKYSONA顯著優(yōu)于現(xiàn)有的異體造血干細(xì)胞移植，且對(duì)于干細(xì)胞移植，患者需要等待很長時(shí)間才能找到匹配的細(xì)胞供體，或者接受不匹配的細(xì)胞供體，這會(huì)導(dǎo)致極高的移植物抗宿主病風(fēng)險(xiǎn)。而SKYSONA使用患者自身的細(xì)胞，消除了等待時(shí)間和移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。盡管存在腫瘤生成風(fēng)險(xiǎn)，但FDA認(rèn)為SKYSONA對(duì)這種侵襲性和致命疾病的好處大于腫瘤生成風(fēng)險(xiǎn)，最終獲得批準(zhǔn)。

關(guān)于插入突變的監(jiān)管考慮

在2022年開會(huì)時(shí)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的8種基因療法，其中7種未報(bào)告有致癌性，另外1種存在插入突變，但由于對(duì)患者有顯著獲益而獲批。

rAAV載體整合導(dǎo)致的致癌性僅在新生小鼠中被報(bào)道，且與小鼠特有的Rian基因座附近整合有關(guān)，而人類并不存在該基因座，因此在人類中尚未發(fā)現(xiàn)由其整合導(dǎo)致的腫瘤形成。此外，在接受治療后長達(dá)10年的大動(dòng)物（如血友病犬）和長達(dá)6年的非人靈長類動(dòng)物中，也未見有腫瘤形成的報(bào)道。

LVs主要整合到轉(zhuǎn)錄活躍的基因中，且多在內(nèi)含子區(qū)域。載體構(gòu)建中存在強(qiáng)啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件是導(dǎo)致整合和高致瘤風(fēng)險(xiǎn)的主要因素。

通常情況下，F(xiàn)DA可能會(huì)要求對(duì)基因療法的基因組完整性進(jìn)行評(píng)估，包括大片段插入或缺失、外源DNA整合、染色體重排以及通過評(píng)估克隆擴(kuò)增或不受控增殖（僅針對(duì)體外修飾細(xì)胞）來判斷潛在的致癌性/插入突變風(fēng)險(xiǎn)。目前，F(xiàn)DA尚未出臺(tái)關(guān)于具體檢測方法或檢測指標(biāo)要求（例如，cut off points）的明確指導(dǎo)。

由于存在整合和致癌的低風(fēng)險(xiǎn)，F(xiàn)DA及其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)會(huì)根據(jù)證據(jù)權(quán)重（WoE）要求對(duì)基因療法患者進(jìn)行5至15年的長期隨訪。

LV基因治療產(chǎn)品致突變性和成瘤性評(píng)估

與AAV不同，LV載體能夠?qū)⑦z傳信息整合到宿主基因組中。LV也因其能夠穩(wěn)定地將基因引入細(xì)胞并在細(xì)胞發(fā)育過程中傳遞給子代細(xì)胞而備受青睞。與早期的RVs相比，目前使用的第三代LV載體引入了多種元素和改良方案，顯著提高了其用于基因治療的安全性。

在LV載體基因治療產(chǎn)品臨床前評(píng)估致突變性和成瘤性的方法很多，比如采用體外工具評(píng)估載體整合和細(xì)胞轉(zhuǎn)化潛力，同時(shí)結(jié)合體內(nèi)組織的整合位點(diǎn)分析（ISA），并采用以上結(jié)果開展致突變性和成瘤性風(fēng)險(xiǎn)的WoE評(píng)估。常用體外插入位點(diǎn)分析方法優(yōu)缺點(diǎn)如下表所示。此外，在細(xì)胞和基因治療的臨床前安全性評(píng)估中，動(dòng)物模型的選擇及其對(duì)終點(diǎn)（如成瘤性）的潛在影響也應(yīng)被考慮。

基于病毒的基因治療載體：致突變性/致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的監(jiān)管視角

一般藥理學(xué)與毒理學(xué)評(píng)估的作用

基于病毒的GT產(chǎn)品的載體整合風(fēng)險(xiǎn)，是需系統(tǒng)解決的非臨床安全性問題之一。對(duì)載體潛在整合風(fēng)險(xiǎn)的初步評(píng)估，始于對(duì)GT載體的全面表征，包括但不限于載體設(shè)計(jì)、關(guān)鍵質(zhì)量屬性、主要放行標(biāo)準(zhǔn)，以及病毒基因組物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核的固有能力、病毒蛋白的可獲得性，或其與細(xì)胞蛋白相互作用介導(dǎo)病毒遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和/或整合的能力。

與AAV等生命周期中無DNA整合步驟的病毒載體相比，慢病毒等以DNA整合為生命周期一部分、經(jīng)工程改造的GT載體，具有更高的插入突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)。

產(chǎn)品特性相關(guān)信息將為初步藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的設(shè)計(jì)與實(shí)施提供依據(jù)。在產(chǎn)品開發(fā)早期，早期研究和確定性研究的累積非臨床數(shù)據(jù)，將指導(dǎo)后續(xù)是否需要開展額外的載體整合和/或致瘤性研究。具體而言，對(duì)藥理學(xué)、生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究的細(xì)致分析，是制定非臨床策略、決策是否需進(jìn)一步評(píng)估靶向和非靶向組織/器官中載體整合、致突變性、遺傳毒性和/或致癌性風(fēng)險(xiǎn)的核心。

這種整體的WoE方法遵循分步、整合的決策流程，以科學(xué)為基礎(chǔ)、數(shù)據(jù)為驅(qū)動(dòng)。需注意，特定GT產(chǎn)品的具體特性將決定非臨床研究策略的方向，只要有科學(xué)依據(jù)，策略可靈活調(diào)整。

在某些情況下，一般毒理學(xué)和其他非臨床研究的觀察結(jié)果可能表明，載體可能整合到影響細(xì)胞形態(tài)和生理功能的基因組位置，包括基因表達(dá)變化、細(xì)胞活力和增殖改變、持續(xù)性變化、器官重量/大小改變，和/或異常病變的出現(xiàn)，或?qū)е缕鞴俣拘浴?duì)于觀察到的任何腫瘤或增生性病變，應(yīng)調(diào)查其起源以及載體是否對(duì)腫瘤發(fā)生有影響。此外，還應(yīng)考慮聯(lián)合治療的潛在毒性、研究動(dòng)物和/或目標(biāo)人群的免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)，以及特定疾病適應(yīng)癥/特定目標(biāo)人群，這些因素可能會(huì)加重載體相關(guān)毒性或調(diào)節(jié)插入突變風(fēng)險(xiǎn)。

載體整合與致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的非臨床考量

評(píng)估載體整合及插入突變、致癌風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，需考慮的主要因素包括：GT載體是否為已知的整合型或非整合型載體、其固有的組織嗜性、是否存在基因組編輯組件、載體骨架設(shè)計(jì)、給藥途徑、給藥劑量水平、長期存續(xù)潛力、靶細(xì)胞/組織/器官對(duì)插入突變的敏感性，以及目標(biāo)人群中易導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)因素。

若有科學(xué)依據(jù)支持開展額外的載體整合和致癌性研究，需重點(diǎn)考慮以下非臨床研究要點(diǎn)：1）非臨床用產(chǎn)品（如早期版本或替代載體）與擬臨床用產(chǎn)品的可比性；2）所選動(dòng)物種屬/疾病模型對(duì)目標(biāo)適應(yīng)癥/患者人群的代表性；3）研究設(shè)計(jì)與實(shí)施要素，包括足夠的研究持續(xù)時(shí)間（腫瘤形成所需）、設(shè)置合適的平行對(duì)照組、每組足夠的動(dòng)物數(shù)量（以確保腫瘤形成本底發(fā)生率等生物學(xué)觀察結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；4）研究終點(diǎn)；5）如果可行，非臨床研究應(yīng)盡可能與臨床方案一致。

研究用的非臨床載體應(yīng)在載體組成、病毒基因組滴度、生產(chǎn)工藝、最終制劑與儲(chǔ)存條件、轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或編輯效率等方面，與擬臨床用載體盡可能一致，并符合主要產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)。

選擇動(dòng)物種屬或模型（包括用于評(píng)估插入突變的細(xì)胞/組織類型）時(shí)，需重點(diǎn)考慮：與人類的比較生理學(xué)/病理生理學(xué)差異、對(duì)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或基因組編輯的允許性、對(duì)產(chǎn)品的藥理反應(yīng)，以及臨床遞送系統(tǒng)或流程的可行性。

載體和轉(zhuǎn)基因的生物分布評(píng)估是重要環(huán)節(jié)，可為是否需要開展整合和致癌性研究提供依據(jù)。設(shè)計(jì)非臨床研究時(shí)，應(yīng)采用靈敏的定量方法檢測相關(guān)動(dòng)物種屬的靶向和非靶向組織中的產(chǎn)品DNA序列，并妥善存檔/儲(chǔ)存收集的組織/器官，以備未來可能的載體整合等分析。若載體持續(xù)存在，藥物研發(fā)者應(yīng)采用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法評(píng)估整合和致癌潛力。有關(guān)設(shè)計(jì)、實(shí)施和解讀載體生物分布研究的更多指導(dǎo)，可參考《Guidance for Industry: Long-Term Follow-up After Administration of Human Gene Therapy Products (2020)》和《International Pharmaceutical Regulators Programme (PRP) Reflection Paper: Expectations for Biodistribution (BD) Assessments for Gene Therapy Products (June 2018)》。

插入突變與致癌風(fēng)險(xiǎn)的分步評(píng)估方法

用于評(píng)估載體整合風(fēng)險(xiǎn)的方法，應(yīng)根據(jù)載體GT產(chǎn)品的具體生物學(xué)特性確定，包括靶轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、這些細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)潛力，以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)（若轉(zhuǎn)基因具有生長因子功能，則尤為重要）。一般而言，若某種測試方法能提供有用信息，幫助更好地理解載體基GT產(chǎn)品的插入突變風(fēng)險(xiǎn)和/或致癌潛力，則可考慮采用。

ICH S2 (R1)中描述的標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性評(píng)估方法不適用于病毒載體，因?yàn)檫@些技術(shù)主要關(guān)注DNA損傷或突變，且適用短時(shí)間暴露。載體介導(dǎo)的突變可能需要數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年時(shí)間。用于檢測載體介導(dǎo)遺傳毒性的檢測方法應(yīng)能夠可重復(fù)地定量插入性突變、測量基因功能的獲得或喪失，并確定插入在染色體中的位置。遺憾的是，監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未制定針對(duì)載體介導(dǎo)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的具體指南，也沒有明確檢測方法。根據(jù)病毒載體的不同，可使用多種檢測方法來評(píng)估遺傳毒性。對(duì)于基因編輯療法，這些檢測方法包括但不限于全基因組范圍的非靶向修飾分析（如插入/缺失定量和/或寡核苷酸整合）、插入位點(diǎn)分析、分子易位檢測（用于評(píng)估靶向位點(diǎn)之間或靶向位點(diǎn)與非靶向位點(diǎn)之間的易位事件）、核型分析、成纖維細(xì)胞軟瓊脂轉(zhuǎn)化試驗(yàn)或低附著生長（GILA）試驗(yàn)以及IL-2細(xì)胞增殖試驗(yàn)。

體外永生化試驗(yàn)（IVIM）和遺傳毒性評(píng)估替代試驗(yàn)組合（SAGA）是兩種常用于評(píng)估整合型載體致突變潛力的體外試驗(yàn)。這些研究結(jié)果可與長期非臨床體內(nèi)研究的安全性終點(diǎn)（如腫瘤形成的大體和微觀證據(jù)、載體和轉(zhuǎn)基因在靶向和非靶向組織中的持續(xù)性，以及任何可能與基因組不穩(wěn)定性或插入突變相關(guān)的延遲毒性）相關(guān)聯(lián)。

開展整合位點(diǎn)分析可確定載體整合的頻率和位置，并可根據(jù)所用方法提供克隆擴(kuò)增相關(guān)信息。

載體整合和/或核酸酶介導(dǎo)的編輯事件的表征，可根據(jù)情況采用基于測序的方法和正交方法，包括計(jì)算機(jī)預(yù)測、深度測序或全基因組測序，以及生化和細(xì)胞方法。

從臨床角度來看，基于載體的持續(xù)性、整合和/或基因組修飾，可能需要進(jìn)行長期隨訪（LTFU），以評(píng)估長期風(fēng)險(xiǎn)和延遲不良事件。

插入突變與致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的挑戰(zhàn)與未來考量

評(píng)估多樣化的AAV或LV GT產(chǎn)品致癌風(fēng)險(xiǎn)的挑戰(zhàn)包括：確定致癌作用機(jī)制/過程；在選擇評(píng)估致瘤性/致癌潛力或預(yù)測臨床結(jié)果的最相關(guān)體外方法和動(dòng)物模型方面，缺乏科學(xué)共識(shí)。目前仍需更好地理解人類面臨的風(fēng)險(xiǎn)、致癌性的潛在機(jī)制和影響因素，以及降低風(fēng)險(xiǎn)的潛在途徑。建議鼓勵(lì)科學(xué)界進(jìn)一步研究這些問題，并在公共領(lǐng)域共享數(shù)據(jù)。

GT產(chǎn)品研發(fā)者必須在整個(gè)產(chǎn)品生命周期中，與藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)保持密切合作，盡早并持續(xù)提供反饋。這需要研發(fā)者熟悉監(jiān)管機(jī)構(gòu)的當(dāng)前思路和監(jiān)管框架、指導(dǎo)文件，并利用機(jī)會(huì)通過會(huì)議（正式或非正式）與監(jiān)管機(jī)構(gòu)就所研發(fā)GT產(chǎn)品的特定問題進(jìn)行溝通。這些互動(dòng)和會(huì)議的主要目標(biāo)是獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的有用反饋，幫助藥物研發(fā)者成功提交IND申請(qǐng)，并開發(fā)出有效且安全的藥物產(chǎn)品。

研發(fā)者在IND申報(bào)中常見的缺陷通常包括：評(píng)估目標(biāo)人群風(fēng)險(xiǎn)的信息不足，包括產(chǎn)品表征不充分、非臨床安全性數(shù)據(jù)有限或缺失、安全性研究報(bào)告不完整、非臨床研究設(shè)計(jì)不當(dāng)和/或?qū)嵤┎患眩ㄈ鐪y試產(chǎn)品與擬臨床用產(chǎn)品存在重大差異、給藥途徑不相關(guān)、劑量水平不合適、研究持續(xù)時(shí)間不足、測試系統(tǒng)不適當(dāng)/不相關(guān)、終點(diǎn)無臨床意義）。

總之，載體基GT產(chǎn)品插入突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)的非臨床評(píng)估應(yīng)遵循全面的WoE方法，并牢記非臨床研究的設(shè)計(jì)目的是支持特定產(chǎn)品用于特定臨床適應(yīng)癥的給藥。

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