AAV基因治療產(chǎn)品相關(guān)動(dòng)物種屬選擇的一些考量

基因治療藥物（Gene Therapy Medicinal Products, GTMPs）的定義：GTMPs是一種包含遺傳物質(zhì)的載體或遞送系統(tǒng)，旨在通過(guò)表達(dá)特定的基因來(lái)修復(fù)、調(diào)節(jié)、替換、添加或刪除遺傳序列。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、低免疫原性、致病性弱、整合風(fēng)險(xiǎn)低、目的基因表達(dá)持久等結(jié)構(gòu)和生物學(xué)方面的優(yōu)勢(shì)，成為體內(nèi)基因治療應(yīng)用最廣泛的載體之一。目前已有至少6種AAV基因治療藥物獲EMA/FDA批準(zhǔn)上市，包括Luxturna、Zolgensma、Glybera、Roctavian、Upstaza和Hemgenix。

眾所周知，非臨床研究數(shù)據(jù)對(duì)于支持臨床試驗(yàn)的啟動(dòng)和后續(xù)的藥品上市許可申請(qǐng)至關(guān)重要。非臨床研究中，選擇合適的動(dòng)物種屬對(duì)于數(shù)據(jù)的臨床有效轉(zhuǎn)化也非常關(guān)鍵。本文討論下AAV基因治療產(chǎn)品選擇非臨床動(dòng)物模型的關(guān)鍵考量因素。

AAV屬于細(xì)小病毒科，具有約4.7 kb的單鏈DNA基因組。目前已鑒定出13種AAV血清型，超過(guò)100種變體。通過(guò)替換AAV的Rep（復(fù)制）和Cap（衣殼）基因，可以將其改造為有效的基因治療載體。當(dāng)然，AAV作為基因治療載體也有一定的風(fēng)險(xiǎn)，比如人體中普遍存在針對(duì)AAV的抗體，可能導(dǎo)致免疫原性問(wèn)題。高達(dá)60%的人群在自然暴露后會(huì)產(chǎn)生抗AAV的中和抗體，這些抗體可以阻止AAV載體與細(xì)胞受體結(jié)合，從而降低基因治療的效果。而且，重復(fù)給藥可能導(dǎo)致更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，故AAV基因治療多為單次給藥。另外，AAV能趨向多種組織，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在非靶組織表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)毒性。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和小型豬中，AAV給藥被發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)的毒性。高劑量AAV還可能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝毒性、心肌炎等不良反應(yīng)。近年來(lái)，研究人員通過(guò)多種策略解決這些問(wèn)題，比較常見的是改造AAV的Cap基因，因?yàn)椴《疽職?duì)細(xì)胞/組織趨向性至關(guān)重要，同時(shí)也是先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。另外一種降低免疫反應(yīng)的策略是改變給藥途經(jīng)。眼睛、大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸和子宮等部位被認(rèn)為是免疫豁免區(qū)域，這些部位對(duì)AAV基因治療的免疫反應(yīng)較弱。例如，Luxturna（AAV2基因治療）通過(guò)視網(wǎng)膜下注射給藥，臨床試驗(yàn)中僅觀察到輕微的免疫反應(yīng)，且未發(fā)現(xiàn)顯著的免疫原性。當(dāng)然，非病毒載體技術(shù)的進(jìn)步也是潛在解決AAV載體免疫原性、毒性、高成本的路徑之一，比如研究較多的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）遞送。

一提到病毒，很多人比較擔(dān)心其傳染風(fēng)險(xiǎn)，甚至遺傳風(fēng)險(xiǎn)。AAV載體有復(fù)制缺陷，通過(guò)水平傳播（如人與人之間傳播）的可能性極低。盡管在人類精液樣本和小鼠睪丸中檢測(cè)到AAV載體，但未在生殖細(xì)胞中檢測(cè)到，且沒有通過(guò)生殖系傳遞給后代的證據(jù)。在臨床試驗(yàn)中（如Glybera治療），也未觀察到生殖系遺傳的證據(jù)。另外，AAV載體在目標(biāo)細(xì)胞核內(nèi)以游離形式存在，整合率極低（0.1%-1%）。在FDA細(xì)胞、組織和基因治療咨詢委員會(huì)的會(huì)議上，討論了AAV載體的潛在安全性問(wèn)題，特別是關(guān)于小鼠接受AAV治療后發(fā)展為肝細(xì)胞癌（HCC）的報(bào)告。目前，尚未在患者中觀察到與AAV載體相關(guān)的腫瘤發(fā)生事件。故，AAV載體的整體安全性其實(shí)并無(wú)太多擔(dān)憂。

AAV載體基因治療的臨床前/臨床轉(zhuǎn)化

AAV基因治療從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)的過(guò)程中，選擇合適的動(dòng)物種屬是關(guān)鍵，選擇動(dòng)物種屬時(shí)可以從4個(gè)方面考慮：1）確認(rèn)受試物在選定動(dòng)物種屬中的藥理學(xué)活性；2）確認(rèn)動(dòng)物對(duì)AAV類型的易感性，即所選AAV可以感染該種屬；3）確認(rèn)AAV的細(xì)胞/組織趨向性：確保AAV載體在動(dòng)物中能夠靶向預(yù)期的細(xì)胞或組織；4）選擇的動(dòng)物模型的生理特征應(yīng)與人類相似，以更好地模擬臨床情況。如下圖所示。

藥理學(xué)活性比較容易理解，不只針對(duì)AAV基因治療，也適用于其它藥物形式的種屬選擇。需要確認(rèn)目的基因在動(dòng)物模型中的效力與人體相當(dāng)。動(dòng)物表達(dá)與人體相同的受體/表位/抗原。藥理學(xué)活性的確認(rèn)可以通過(guò)體外或體內(nèi)試驗(yàn)方法確認(rèn)。根據(jù)EMA指南（Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products），對(duì)于基因治療藥物（GTMPs）的新型AAV基因治療，非臨床安全性研究可以僅在一個(gè)動(dòng)物種屬中開展。這點(diǎn)與傳統(tǒng)的化藥和生物藥的雙種屬要求不同。如果所選擇的動(dòng)物模型不能充分反映臨床風(fēng)險(xiǎn)，則需要多個(gè)動(dòng)物種屬交叉確認(rèn)。不過(guò)，NMPA《腺相關(guān)病毒載體基因治療產(chǎn)品的非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》建議應(yīng)獲得兩種相關(guān)動(dòng)物種屬（嚙齒+非嚙齒）的非臨床安全性信息，若僅采用一種相關(guān)動(dòng)物，需要提供科學(xué)合理的依據(jù)。已上市的6款A(yù)AV基因治療藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)所用種屬分別為，Luxturna（犬、猴）、Zolgensma（小鼠）、Roctavian（小鼠、猴）、Upstaza（GLP大鼠，non-GLP猴）、HEMGENIX（小鼠、猴）、Glybera（小鼠）。

如果無(wú)藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物模型，可以考慮采用在動(dòng)物中有藥理學(xué)活性的替代分子開展研究，比如CD19-CAR T產(chǎn)品Yescarta和 Tecartus。除以上外，NMPA提醒在動(dòng)物篩選及分組時(shí)需關(guān)注預(yù)存抗體及其對(duì)體內(nèi)藥物暴露的可能影響，盡量選擇預(yù)存抗體陰性的動(dòng)物用于試驗(yàn)。

確認(rèn)AAV載體在選定的動(dòng)物種屬中是否可感染是相關(guān)動(dòng)物種屬選擇的另一個(gè)關(guān)鍵因素。AAV載體必須能夠繞過(guò)宿主免疫系統(tǒng)，并在動(dòng)物和人體中以類似的方式發(fā)揮作用。如果AAV載體在選定的非臨床動(dòng)物種屬中不被接受，即不具備感染可能，也就不宜作為相關(guān)種屬開展后續(xù)研究。

除了感染敏感性，AAV載體是否對(duì)非臨床動(dòng)物種屬和人體的細(xì)胞/組織具有趨向性，也是相關(guān)種屬選擇的重要依據(jù)之一。感染敏感性、細(xì)胞/組織趨向性可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)初步確定，再通過(guò)體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步確證。常見AAV血清型不同種屬組織趨向性特點(diǎn)如下表所示。

嚙齒類動(dòng)物是可以用于AAV基因治療的關(guān)鍵非臨床安全性研究的。不過(guò)，如果從小動(dòng)物到人體的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化存在挑戰(zhàn)，則可能需要使用大型動(dòng)物模型（如小型豬、犬或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物）。比如，解剖學(xué)差異可能限制某些給藥途徑的操作實(shí)施。另外，由于對(duì)背根神經(jīng)節(jié)（DRG）毒性的擔(dān)憂，考慮到非人靈長(zhǎng)類在AAV給藥后表現(xiàn)出與人類相似的DRG毒性，這類動(dòng)物也可以考慮，且監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可。選擇的非臨床動(dòng)物種屬與人類之間的生理差異也必須考慮，以確保動(dòng)物生成的數(shù)據(jù)能夠準(zhǔn)確轉(zhuǎn)化為人體。

另外，通過(guò)廣泛的文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，AAV基因治療產(chǎn)品最常用的種屬是小鼠，其次是大鼠，如下表所示（I.V. Intravenous, I.C. Intracardiac, I.Per. Intrapericardial, I.Cor. Intracoronary, I.M.Intramuscular, I.Vit. Intravitreal, Sub.Ret Subretinal, S.C. Subcutaneous.）。大小鼠常用的原因是繁殖速度快、易于飼養(yǎng)和操作，且能夠進(jìn)行遺傳操作，產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因品系。此外，現(xiàn)有的近交系特征明確，涵蓋免疫功能正常和免疫缺陷的品系，且有大量商業(yè)化試劑可用。近年來(lái)，人源化小鼠模型也被用于AAV基因治療藥物的開發(fā)。這些模型在目標(biāo)基因在所選動(dòng)物中不表達(dá)時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，但使用這些模型也存在挑戰(zhàn)，比如模型復(fù)雜，難以按照GLP要求進(jìn)行操作，且可能難以區(qū)分安全性和有效性問(wèn)題。

在非臨床研究中，犬類（尤其是比格犬）曾是AAV基因治療最常用的非臨床研究大動(dòng)物種屬，例如Luxturna。然而，近年來(lái)由于倫理問(wèn)題，犬作為首選大型動(dòng)物模型的地位受到質(zhì)疑，小型豬的使用在逐漸增加。小型豬因其生理和解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，已成為標(biāo)準(zhǔn)的毒理學(xué)模型之一。其中，哥廷根小型豬（G?ttingen Minipig）因其基因組特征明確、歷史背景數(shù)據(jù)豐富而備受關(guān)注，盡管這些歷史數(shù)據(jù)主要來(lái)自小分子藥物研究。哥廷根小型豬在AAV基因治療研究中也得到了廣泛應(yīng)用，例如用于靶向肝臟的AAV研究、針對(duì)亨廷頓病的AAV-miHTT基因治療，以及FDA批準(zhǔn)的AAV基因治療藥物Zolgensma的非臨床研究。

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物因其與人類在進(jìn)化關(guān)系、生理和藥理學(xué)方面高度相似，也是AAV基因治療藥物非臨床研究的選擇之一。然而，由于倫理問(wèn)題，使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的前提是，受試物在其他毒理學(xué)常用種屬中無(wú)藥理活性。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物被用于Luxturna和Zolgensma等藥物的非臨床研究。

以上基本是從AAV，也就是病毒載體的角度，思考如何選擇合適的種屬。除此以外，AAV攜帶的目的基因也要納入考量。這點(diǎn)，NMPA在其指導(dǎo)原則里面有清晰描述，動(dòng)物相關(guān)種屬選擇需考慮動(dòng)物對(duì)AAV載體攜帶的目的基因的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)可行性及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)與預(yù)期的人體效應(yīng)的相似性。這點(diǎn)比較常規(guī)，不再展開，可以借鑒生物藥的一些思路。

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