國外病原微生物快速檢測鑒定技術研究進展

在受生物污染或生物武器攻擊的戰場上，越早檢測出生物戰劑的種類，越能快速適配治療方案，降低傷亡，直接關系部隊的戰斗力和人員安全。目前，國外相關領域的研究正將病原微生物檢測能力從實驗室推向戰場前沿。

一、基礎研究方向

1.1從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統

長久以來，病原體快速檢測仍以PCR(鏈式聚合酶反應)技術為主，但其發展方向開始從操作復雜的實驗室設備轉向小型自動化和低操作門檻的便攜式設備。

從樣本到到答案一體化系統的目標是將樣本處理、核酸提取/富集、擴增、檢測、判讀等一系列操作過程封裝在一次性密封耗材和一個小型儀器內，操作者只需進行極少的步驟，系統即可自動給出定性或定量結果。

表.從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統的組成

美國國防部自2017財年起開始采購由美國BioFire Defense公司研發的Film Array 2.0，該系統可檢測臨床樣本(血液、痰液等)和環境樣本(空氣、土壤和水)中的生物戰劑(炭疽、鼠疫、土拉弗雷熱、Q熱、埃博拉和馬爾堡病毒等)，任何人員(包括無技術背景的人員)可在2分鐘內完成上樣，并在1小時內出具檢測結果。

圖. Film Array 2.0系統

另一種被美軍廣泛使用的設備是美國Cepheid公司的GeneXpert系統。該系統具備多通道檢測能力，可在45分鐘內出具結果。2022年，美軍與該公司簽訂了5.6億美元的合同用于相關設備的采購。

圖. GeneXpert 4和GeneXpert 16系統

1.2 CRISPR分子診斷

CRISPR分子診斷(CRISPR-Dx)是基于CRISPR-Cas系統的特異性核酸識別能力，利用Cas12/Cas13蛋白被靶序列激活后的“旁切活性”切割熒光報告分子，實現快速信號輸出。

相比于傳統PCR技術，CRISPR分子診斷的特異性強、可擴展性強、適用范圍廣、靈敏度極高，因此很適合用于新病原的檢測。然而其熒光報告強度和反應動力學受溫度和樣本抑制等影響，因此整個反應體系并不十分穩定。

圖.幾種CRISPR分子診斷系統的原理

2022年，美國Sherlock Biosciences公司(CRISPR系統的發明者成立的公司)的產品便采用該技術，已通過FDA的審核用于新冠病毒的檢測，但是由于嚴格的質量控制、批間一致性、干擾驗證等因素，該試劑盒僅限于緊急情況下使用。

1.3宏基因組與第三代測序

宏基因組測序(mNGS)是一類非靶向的核酸檢測方法,通過對樣本中所有的核酸樣本進行高通量測序，再通過生物信息學的方法對結果進行識別，從而在一次檢測中同時覆蓋細菌、病毒、真菌、寄生蟲等多類微生物，并能在混合感染或非常規病原場景下提供額外檢出價值。

第三代測序是指長讀長測序(long-read sequencing)，主要的技術平臺是納米孔測序(ONT)，可以實現邊測序邊分析，準確率達到99%以上，從樣本到初步結果的時間僅需數小時甚至更短。納米孔測序設備的尺寸十分小巧(通常只有手掌心大小)，可以直接連接到電腦，實時讀取檢測結果。

圖.納米孔測序原理(左圖)和設備(右圖)

1.4宿主反應(host-response)

相比于前幾種技術，基于宿主反應的檢測技術并不是檢測病原體本身，而是檢測人體在感染后產生的免疫-炎癥反應模式，用這些反應模式去判斷是否感染以及感染病原的類型、病情嚴重程度和進展風險。它的優勢在于，當病原載量很低、取樣部位不理想或病原突變導致靶標檢測漏檢時，宿主反應仍可能給出“機體免疫系統已經被病原激活”的信號;同時還能在一定程度上區分感染與無菌炎癥，從而支持抗菌藥物的更精細決策。

目前，制約病原微生物快速檢測鑒定技術發展的主要瓶頸是樣本的前處理，主要原因在于：

(1)低載量：在感染早期、用藥后或血流感染時樣本里病原體的含量較少，檢測難度高。

(2)強抑制物/復雜基質：血液、痰液、糞便、土壤/污水里有會抑制擴增/酶反應或干擾傳感器讀數的成分。

(3)裂解與回收效率差異大：革蘭陽性菌、分枝桿菌、真菌、芽孢、包膜病毒等難裂解的樣本會導致假陰性風險上升。

(4)富集和速度的矛盾：更靈敏的檢測技術往往要對樣本進行富集和純化，但這會直接拖慢檢測速度。

二、美軍的相關研究項目

美國國防高級研究計劃局(DARPA)推動了多個病原微生物檢測技術的研發項目，包括利用基因編輯技術進行檢測項目(DIGET)和表觀遺傳特征和觀察項目(ECHO)。

2.1 利用基因編輯技術進行檢測項目(DIGET)

DIGET項目由DARPA于2019年發起，項目周期4年(目前已完成)，依托CRISPR-Cas12/Cas13基因編輯技術，結合等溫擴增、微流控、合成生物學和生物信息學技術，目標是解決美軍對快速、高可信度、可靈活適配的診斷與生物監測技術的迫切需求。對于該項目，美軍要求承包商交付2種產品：

(1)一次性即時診斷試劑盒，可檢測多達10種病原體和宿主生物標志物。

(2)用于同時檢測1000個或更多樣本的可復用檢測設備。

表. DIGET項目的技術要求

2.2 表觀遺傳特征和觀察項目(ECHO)

ECHO項目于2018年發起，周期4年(目前已完成)，目標是解決大規模殺傷性武器(WMD)及前體暴露檢測的痛點，即現有方法依賴殘留的生物痕跡(易消失、濃度低)，且需實驗室環境，無法在野外快速應用。項目通過分析個人表觀基因組，和暴露后的持久分子印記，實現對WMD暴露的溯源與診斷，支撐軍事反恐及防擴散任務。

該項目基于RNA-SEQ(基因表達分析)、ChIP-SEQ(組蛋白修飾檢測)、WGBS(DNA甲基化分析)等分子生物學方法結合生物信息學工具和微流控技術，交付2種產品：

(1)ECHO特征檢測板：可檢測21種暴露特異性特征(4種必選生物制劑+17種自選類別，涵蓋化學、放射性、爆炸物等10類)，可區分暴露類型及暴露時間。

(2)便攜式集成檢測設備：集成樣本處理、表觀遺傳分析、結果解讀功能，適用于野外環境，無需專業操作人員。

表. ECHO項目的技術要求

三、總結

總體來看，國外病原體快速檢測技術發展的共性特點與趨勢如下：

(1)速度和可適配并重：不僅追求分鐘級到小時級出結果，也強調新靶點快速上線與大通量檢測。

(2)從檢病原走向檢狀態：通過宿主反應和表觀遺傳等方法，把檢測目標從特定病原轉向機體狀體，提升檢測的廣譜性。

(3)面向戰場前沿：為滿足戰場的使用需求(檢測速度快，人員要求低)，檢測設備向小體積、低功耗、低操作難度、結果準確、直觀易懂的方向發展。(北京藍德信息科技有限公司)