脂質納米顆粒核酸遞送的六十年演變

引言

1958年，F(xiàn)rancis Crick提出了分子生物學的中心法則，指出遺傳信息從DNA流向RNA再流向蛋白質。隨后，Alexand及其同事發(fā)現(xiàn)高鹽濃度可增強病毒RNA的低感染力，此后利用堿性蛋白和DEAE葡聚糖等轉染方法顯著提高了感染力。1973年，磷酸鈣-DNA共沉淀法被證明能進一步提高純化病毒DNA的感染力。隨著重組DNA技術的發(fā)展，將鈣磷酸鹽和DEAE葡聚糖介導的轉染方法應用于重組質粒在培養(yǎng)哺乳動物細胞中的遞送和表達，促進了基因工程的發(fā)展。

早期關于體內基因遞送的研究表明，注射含有病毒基因組的“裸”質粒可能導致感染。例如，1979年證實多瘤病毒質粒DNA在親代給藥后對小鼠和倉鼠具有感染性。然而，裸質粒基因遞送方法的臨床應用受到限制，歸因于轉染效率低下以及DNA隨機自發(fā)整合入人類基因組等問題。與此同時，使用病毒載體的基因療法常與免疫反應相關，這雖然對體細胞基因治療不利，卻促進了基于病毒載體的疫苗開發(fā)。核酸疫苗相比經(jīng)典疫苗具有重要優(yōu)勢，其合成的蛋白質在細胞內被分解并通過MHC I類分子呈遞，激活CD8+細胞毒性T細胞，從而刺激細胞免疫。

目前大多數(shù)正在開發(fā)的基因療法使用病毒遞送系統(tǒng)，如腺相關病毒載體，但其在遺傳容量、免疫原性和制造方面面臨阻礙。相比之下，非病毒脂質基遞送系統(tǒng)如脂質納米顆粒，因其在安全性、耐受性、可重復給藥、大遺傳載荷、易于設計和制造等方面的優(yōu)勢，可能會成為主導。

一、脂質體與脂質復合物的早期研究

1. 脂質體的發(fā)現(xiàn)與表征

1964年，人們發(fā)現(xiàn)卵磷脂在水性介質中的分散體產(chǎn)生了由同心脂質雙層組成的多層系統(tǒng)，這支持了脂質在生物膜中提供滲透性屏障的提議。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了表征脂質生物物理特性及其在膜中功能角色的密集研究。脂質體一詞通常被理解為指代由脂質以雙層結構組織而成的納米或微米級顆粒的水性分散體。多種制劑方法被開發(fā)出來，包括1969年的超聲處理、1973年的乙醇注入法、1979年的擠壓法等，以產(chǎn)生不同大小和結構的脂質體。

早期致力于生成包含核酸的脂質體系統(tǒng)，始于1977年發(fā)現(xiàn)mRNA可被封裝于通過乙醇制劑技術產(chǎn)生的脂質體中。1982年，使用非感染性重組質粒DNA的體內基因遞送和表達得到證實，顯示脂質體封裝的含有大鼠前胰島素原基因的pDNA在靜脈給藥后可在體內表達。然而，這些研究受到封裝效率低、表達水平低和無法規(guī)模化制劑工藝的限制。例如，脂質體在水性介質中的捕獲體積僅占總水性體積的一小部分，因此通過“被動”封裝過程進行的DNA和mRNA封裝效率很低。此外，帶有負電荷表面的脂質體排斥帶負電荷的核酸，也抑制了封裝。

2. 陽離子脂質與脂質復合物的突破

1987年，F(xiàn)elgner假設帶正電荷的脂質體可能提供一種增強帶負電荷核酸聚合物封裝效率的方法。基于脂質體研究的設計原則，合成了一系列陽離子脂質分子，其中N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）是主要例子。當DOTMA與等摩爾水平的“輔助”脂質如DOPC或DOPE混合并分散在水性介質中時，會產(chǎn)生非常小、穩(wěn)定、帶正電荷的脂質體。當這些脂質體與pDNA混合時，可以形成大小和形態(tài)各異的“脂質復合物”。

脂質復合物的結構敏感于所用輔助脂質的相偏好。當輔助脂質為DOPC時，核酸似乎被夾在同心脂質雙層之間。相反，當輔助脂質為DOPE時，低角X射線散射和電子顯微鏡顯示核酸被包含在脂質以無序六角HII相形成的親水管中。這種脂質復合物代表了相較于以往轉染方案的重要封裝進步，也是通過合理設計構建具有轉染能力的納米顆粒的潛在起點。

脂質復合物無需添加額外功能基團即可將pDNA和mRNA高效轉染至培養(yǎng)細胞中。研究發(fā)現(xiàn)，在陽離子脂質體中摻入等摩爾水平的偏好HII相的脂質DOPE可提高轉染效率，這與其在膜融合事件中的作用一致，可能與增強脂質復合物與內體膜之間的融合事件有關。相反，摻入偏好雙層的脂質DOPC則抑制轉染。如今，DOTMA–DOPE轉染試劑在分子生物學實驗室中得到廣泛應用。

Vical公司致力于開發(fā)陽離子脂質制劑的體內基因遞送應用。初步研究表征了脂質復合物DNA和mRNA直接注射入小鼠組織（包括肌肉）后的基因表達。骨骼肌中觀察到高基因表達水平。值得注意的是，即使是不含陽離子脂質的“裸DNA”對照組，其基因表達水平也與含陽離子脂質的組相當。這一意外發(fā)現(xiàn)確立了Vical在裸DNA基因治療和疫苗領域的領導地位。隨后觀察到的高轉染水平被歸因于壓力誘導效應，使大分子能夠通過肌肉細胞膜的暫時性破裂通過。

二、脂質納米顆粒遞送系統(tǒng)的演變

脂質納米粒子系統(tǒng)的演變建立在對雙層脂質體系統(tǒng)的理解之上，但也嚴重依賴于脂質多態(tài)性和脂質不對稱性的基礎研究，以及開發(fā)抗癌藥物脂質體制劑的經(jīng)驗。

1. 脂質多態(tài)性與不對稱性的啟示

脂質多態(tài)性是指生物膜中很大比例的脂質在水性介質中優(yōu)先采用非雙層結構如六角HII相的有趣發(fā)現(xiàn)。1978年，Cullis和Hope提出非雙層脂質在提供膜融合所需的中間結構中具有直接作用。2001年發(fā)現(xiàn)，將陽離子脂質與生物膜中發(fā)現(xiàn)的帶負電荷的雙層形成脂質混合會導致HII相結構的形成。這一發(fā)現(xiàn)與陽離子脂質破壞生物膜中雙層結構以實現(xiàn)核酸貨物細胞內遞送的能力一致。

脂質不對稱性研究也為LNP核酸遞送系統(tǒng)的發(fā)展提供了必要的見解和工具。這些研究始于確定生物膜中觀察到的脂質不對稱跨雙層分布的后果，并表明pH梯度可調節(jié)脂質囊泡中弱堿和弱酸脂質的跨雙層分布。隨后的工作集中在理解影響雙層囊泡系統(tǒng)間膜融合的因素，顯示可離子化陽離子脂質的摻入可響應pH梯度產(chǎn)生脂質不對稱性。此外，PEG脂質對膜融合的影響研究表明，短鏈（C14）PEG脂質可從囊泡解離從而允許融合進行。這些概念對于開發(fā)有效的LNP siRNA和mRNA遞送系統(tǒng)至關重要。

2. 小分子藥物脂質體制劑的經(jīng)驗

開發(fā)小分子藥物脂質體制劑所獲得的見解為設計基因治療LNPs提供了重要指導。1986年，隨著脂質體制備和載藥的可擴展程序的開發(fā)，旨在更準確地將小分子遞送至疾病部位的研究正式開始。擠壓技術被證明適用于生產(chǎn)直徑100 nm或更小的脂質體系統(tǒng)。隨后發(fā)現(xiàn)了可擴展的pH“遠程裝載”技術用于將弱堿藥物裝載入脂質體。PEG涂層賦予脂質體系統(tǒng)長循環(huán)半衰期，使其能優(yōu)先分布至腫瘤部位。這些工作導致FDA批準了十余種脂質體產(chǎn)品，主要含有抗癌藥物。學到的主要教訓是，脂質體系統(tǒng)必須小（直徑<100 nm）、長循環(huán)，并由促進長循環(huán)半衰期的脂質組成。

3. 穩(wěn)定化核酸脂質顆粒（SNALP）的開發(fā)

1990年代中期，Inex Pharmaceuticals和UBC的合作致力于開發(fā)脂質基核酸遞送系統(tǒng)，使其在靜脈注射后能表現(xiàn)出到達腫瘤等疾病部位所需的長循環(huán)半衰期。含有永久帶正電荷陽離子脂質的脂質基系統(tǒng)因激活補體并被迅速清除而不理想。因此，努力轉向開發(fā)在生理pH值下凈中性電荷的遞送系統(tǒng)。

1999年開發(fā)了第一個此類系統(tǒng)，稱為穩(wěn)定化質粒脂質顆粒（SPLP），使用少量陽離子脂質DODAC和PEG脂質通過洗滌劑透析法制備。PEG脂質的存在對于防止制劑過程中的聚集是必要的。靜脈給藥的SPLP顯示出比復合物明顯更長的循環(huán)壽命和更低毒性。隨后的研究表明，含有短鏈PEG脂質的SPLP配方能調節(jié)其轉染特性，這可能歸因于其從脂質基系統(tǒng)解離的能力。

2001年，展示了利用最初為脂質不對稱性研究開發(fā)的可離子化陽離子脂質DODAP，將反義寡核苷酸封裝入脂質基系統(tǒng)（SALP）。研究表明，在pH值低于可離子化脂質pKa的條件下混合核酸聚合物與含有可離子化陽離子脂質的脂質體，它們應因可離子化脂質的正電荷而結合。隨后利用T型管混合器進行乙醇中脂質與pH 4緩沖液中pDNA的快速混合，產(chǎn)生了小型帶正電荷囊泡，隨后與帶負電荷DNA結合，實現(xiàn)了無需擠壓的可擴展方法。

為了增強脂質載體與內體膜融合的可能性，利用陽離子脂質與內源性陰離子脂質結合誘導膜破壞性HII相的觀察，設計了可離子化陽離子脂質DLinDMA。在此基礎上，Protiva與Alnylam合作，將設計用于沉默ApoB的siRNA封裝入稱為穩(wěn)定化核酸脂質粒子（SNALP）的SALP版本中。盡管觀察到小鼠和非人靈長類動物中ApoB的減少，但配方的效力或治療指數(shù)不足以進行臨床開發(fā)。

4. LNP技術的優(yōu)化與臨床轉化

2010年，報道了通過優(yōu)化可離子化脂質成分的頭基，可顯著改善LNP siRNA配方的基因沉默效力。此時，SPLP、SALP和SNALP等配方被描述為LNPs家族的一部分。這些系統(tǒng)不能被稱為脂質體，因為它們可表現(xiàn)出納米結構的疏水內部。改善效力的理性假設是，當可離子化陽離子脂質在被攝取入肝細胞后的內體低pH環(huán)境中質子化時，它們與內源性陰離子脂質結合，通過形成膜破壞性非雙層中間體引發(fā)融合，從而使核酸釋放進入細胞質。DLinKC2DMA被鑒定為更有效的可離子化脂質。2012年，DLinMC3DMA被鑒定為主要可離子化脂質，其pKa被證明是LNP活性的關鍵決定因素，最活躍的脂質表現(xiàn)出pKa為6.4。

次年，健康志愿者的I期臨床試驗顯示，含有DLinMC3DMA和siRNA的LNP系統(tǒng)在肝臟中引起快速且強效的轉甲狀腺素蛋白下調。隨后的III期臨床試驗在治療轉甲狀腺素蛋白誘導的淀粉樣變性方面取得了優(yōu)異結果，導致FDA于2018年批準Onpattro。Onpattro現(xiàn)已給藥部分患者長達10年，未報告因累積效應引起的不良事件。

值得注意的是，用于封裝和遞送siRNA的封裝工藝和脂質成分也可應用于更大的RNA分子。2012年證明，為siRNA遞送開發(fā)的LNP也可用于封裝編碼呼吸道合胞病毒F蛋白的自擴增RNA，并在小鼠肌肉注射后觀察到強效且保護性的免疫反應。隨后2015年研究表明，編碼促紅細胞生成素的mRNA可封裝入LNP系統(tǒng)，靜脈給藥后在豬模型中導致循環(huán)中高水平促紅細胞生成素

-04-
三、LNP mRNA疫苗與治療藥物的影響

COVID-19 LNP mRNA疫苗具有改變世界的影響力，僅2021年就估計挽救了近1000萬人的生命。這一影響力正被其他依賴LNP遞送系統(tǒng)的RNA療法的潛在臨床應用日益超越。目前有超過60種使用LNP遞送技術的疫苗和治療藥物已獲批或正在臨床開發(fā)中。

目前可用的LNP技術正用于治療可利用肝臟靶點的廣泛疾病，包括心血管疾病、肝纖維化和罕見疾病如丙酸血癥。LNP介導的基因編輯方法在肝臟中失能致病基因具有巨大潛力。例如，一項通過LNP介導的PCSK9堿基編輯預防動脈粥樣硬化的治療已在臨床上得到證明。

-05-
結語

LNP系統(tǒng)在遞送基于核酸的疫苗和治療藥物方面的巨大成功正在開啟新一代基因療法。這些系統(tǒng)在遺傳容量、可重復給藥、可擴展性、易于制造、低成本以及高度個性化靶向治療的潛力方面表現(xiàn)出壓倒性的優(yōu)勢。LNP遞送系統(tǒng)賦能的基因療法的前景顯然是變革性的。

參考文獻：

The 60-year evolution of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Nat Rev Drug Discov. 2024 Sep;23(9):709-722.

公眾號已建立“小藥說藥專業(yè)交流群”微信行業(yè)交流群以及讀者交流群，掃描下方小編二維碼加入，入行業(yè)群請主動告知姓名、工作單位和職務。