與癌癥發生發展有密切關系這一基因檢測，為何腫瘤患者很少做？

作者：閔

腫瘤基因檢測的點突變、擴增以及融合等突變類型與我們的治療息息相關，如EGFR基因的點突變、ALK基因融合突變等等。除了這些突變類型以外，還有另一種突變形式名為“甲基化”，它們很少出現在廣大病友的視線里，但卻與癌癥發生發展有密切關系。甲基化檢測相比其他腫瘤基因相關檢測有些“默默無聞”，今天就給大家介紹一下這個小透明，順便聊聊它們的優勢與缺陷。

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什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是基因表觀修飾的方式之一，可以調控基因表達的時機及表達的量度，具有十分重要的生物意義。現有研究發現DNA甲基化與人類多種疾病的發生發展相關，包括腫瘤、糖尿病以及自身免疫性疾病等等。現有研究表明多種癌癥的發生發展與DNA甲基化有關。甲基化通常抑制基因表達，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島（C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，二者會在DNA部分區域高度聚集，類似海中的小島，故稱為“CpG島”）中的CpG呈高度甲基化會使得抑癌基因表達下降，這就給了癌癥可乘之機。

以上是DNA甲基化的生物學作用，它在分子層面的本質是指在DNA甲基化酶的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，并將甲基團選擇性添加到胞嘧啶上形成5’-胞嘧啶的過程。

打個比方，這就像是給胞嘧啶戴上了一頂名為“甲基”的帽子，讓原本認識它的工友不認識他了，使得他的工作不易開展。

DNA甲基化通常發生在CpG或者CpHpG密集的點位，這類成簇的CpG島大多在基因的啟動子區域。

現已發現人類60%的基因啟動子會含有此類CpG島，半數以上的編碼基因與CpG島有關。

圖片來源：包圖網

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DNA甲基化的檢測方式

DNA甲基化可使用PCR、NGS以及質譜等方式檢測。與各位熟悉的腫瘤基因檢測不同的是，甲基化檢測最常選用的檢測方式為PCR。

PCR技術簡便、高效、快速、可重復的特點對于甲基化檢測是重要的優勢。根據實驗設計思路的不同，甲基化檢測的PCR技術還可以細分為甲基化特異性PCR、甲基化特異性的高分辨率溶解曲線法以及數字PCR法，三者間各有側重點。

NGS高通量的特點在此并不占很大優勢，相反其操作繁瑣、技術復雜的特點在甲基化檢測中成為了劣勢。

除了這二者以外，還有一項各位不太熟悉的檢測技術可用于甲基化的檢測，那就是質譜技術。核酸質譜平臺可以同時檢測數個至數十個DNA甲基化標志物，檢測通量適中，質譜還可以獲得最大500bp范圍之內全部連續的CpG位點的甲基化定量水平信息。質譜有時受到遺傳多態性的DNA序列干擾，降低酶切片段質量從而影響定量分析結果。

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DNA甲基化檢測有何用處，是否靠譜？

前文介紹了DNA甲基化的生物學功能及檢測方式，該項技術在臨床及市場化應用主要集中在癌癥早期篩查領域。近年來甲基化檢測的早篩產品層出不窮，篇幅限制不一一介紹，筆者選取一款較為經典且個人比較熟悉的甲基化檢測項目作為代表，向大家簡單介紹這類檢測的具體用途。

Septin9甲基化檢測應該是國內最早投入使用的甲基化標志物，它起初主要用于腸道腫瘤的早期篩查。Septin家族是一個廣泛存在于除植物以外的絕大多數真核生物中的基因家族，它們參與細胞內質的分泌和運輸，具有十分重要的生物學功能。Septin9屬于SEPT3亞家族，Septin9甲基化與腸癌的發生發展高度相關，其在腸癌的各個階段（I-IV期）均有檢出且隨著分期越靠后其檢出率越高。由于Septin9甲基化檢測的定位是早期篩查，因此它采用血液作為常規樣本，與我們熟悉的腫瘤基因檢測有所不同。2011年，德國一項研究發現I期腸癌患者中約有71%的患者檢測到Septin9甲基化，III期及IV期患者檢出率逼近100%[1]。

圖片來源：作者提供

同一研究中，德國學者納入了50名未經治療的結直腸癌患者以及94名健康人群作為對照，并定義靈敏度為X/50及特異性為（1-X/94）。靈敏度體現了該檢測篩查并發現潛在腸癌患者的能力，而特異性體現了該檢測誤診健康人群的概率（特異性越高越不易受其他因素干擾）。最終該研究發現Septin9甲基化檢測的靈敏度達90.0%，特異性則為88.3%。

2014年我國曾有過一版《中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南》（后簡稱指南），該指南就納入了Septin9甲基化檢測，與糞便潛血實驗并列作為低危人群初篩的手段[2]。

自Septin9甲基化檢測在國內成功獲得注冊證及相關指南認可后，DNA甲基化檢測項目如雨后春筍般不斷出現，至今已獲得我國NMPA批準的相關試劑盒多達數十種，這里就不按具體試劑盒列舉，只標注有哪些DNA甲基化檢測項目，以供各位了解。

除了上表中已拿證產品，還有諸如UriMee等與專家合作研發的LDT檢驗項目，DNA甲基化檢測項目的數量遠比這些要多。

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DNA甲基化檢測仍有缺陷？

我們仍以Septin9甲基化檢測為例，盡管它已被納入相關篩查指南，但始終沒有在全國廣泛應用，受到幾點關鍵缺陷制約。

雖然它在德國的研究中展現出不俗的靈敏度與特異性，但經其他多項研究后驗證發現這兩項數據并不穩定。2016年一項匯總研究綜合14項實驗，發現Septin9甲基化檢測整體靈敏度僅60%，特異性為91%。靈敏度如此大的波動可能受患者數量、檢測技術、乃至檢測基因單一等因素限制，好在特異性表現還算穩定[3]。

Septin9甲基化檢測對標的是糞便潛血實驗（iFOBT），后者是當下腸癌篩查常用的方式之一，但苦于靈敏度偏低且特異性也不理想，易受腸道潰瘍、炎癥甚至痔瘡等多種肛腸疾病干擾。鑒于糞便潛血的篩查性能有限，臨床上也需要其他方式來更好的篩查出潛在的腸癌患者以便及時治療。

臺灣的一項研究對比了iFOBT與Septin9甲基化檢測的性能，結果Septin9甲基化檢測的靈敏度為61.8%，特異性為89.6%，而iFOBT這二項數據分別為61.4%與70.3%，二者相結合可將靈敏度提升至84.1%[4]。以往也有研究綜合三個類似對比試驗，其得到的結論也與臺灣的研究相近，尷尬表明Septin9甲基化檢測的性能僅略優于iFOBT。

如上所示，Septin9甲基化檢測的檢測性能對比iFOBT這種基本篩查方式提升有限，達不到替代病理的程度，二者陽性皆需做腸鏡復核確認，加之其檢查費用又高出許多（Septin9甲基化曾在江蘇省定價1000元/次，相較之下糞便潛血僅六七十元），種種原因相加致使它的推廣受阻。其余DNA甲基化檢測多少與之類似，難免有些食之無味、棄之可惜，這才讓整個甲基化篩查領域受冷。

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展望

DNA甲基化與腫瘤的發生發展密切相關，是完善腫瘤早期篩查，實現早診早治理念的有效工具，但仍有需要改進的地方。現在的甲基化檢測正在向多基因聯合檢測的方向發展，想必可進一步提升靈敏度與特異性，然而另一方面也需要與實際應用結合，成為老百姓真正能用得起用得上的防癌好幫手。

參考文獻

[1].Warren J D, Xiong W, Bunker A M, et al. Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer[J]. BMC medicine, 2011, 9(1): 133.

[2].柏愚, 楊帆, 馬丹, 等. 中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南 (2014 年, 北京)[J]. 胃腸病學, 2015, 20(6): 345-365.

[3].Yan S, Liu Z, Yu S, et al. Diagnostic value of methylated septin9 for colorectal cancer screening: a meta-analysis[J]. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2016, 22: 3409.

[4].Xie L, Jiang X, Li Q, et al. Diagnostic value of methylated Septin9 for colorectal cancer detection[J]. Frontiers in oncology, 2018, 8: 247.

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