這種技術(shù)的出現(xiàn)，讓我們看見了生物體內(nèi)前所未見的微觀世界 | 科學(xué)講壇——鞏巖

做了30年的科研工作，

我的體會(huì)就是如果你認(rèn)準(zhǔn)一個(gè)目標(biāo)，

就一定要堅(jiān)持做下去。

鞏 巖· 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所研究員

格致論道第45期 | 2019年9月22日 北京

這是一個(gè)關(guān)于突破光學(xué)衍射極限，打造觀測微觀世界慧眼的故事。

2018年世界衛(wèi)生組織公布了世界癌癥患者的數(shù)量，共有1810萬癌癥患者，其中960萬人死于癌癥。我國是人口大國，每年都有很多新增癌癥患者。在我國，平均每分鐘就有7人被確診為癌癥患者，每5分鐘就有5人死于癌癥。

實(shí)際上，在我們平時(shí)說話的同時(shí)，可能已經(jīng)有5個(gè)家庭永遠(yuǎn)失去了他們的親人。這個(gè)數(shù)字非常驚人，也非常令人痛心。為什么會(huì)有這樣的情況？問題到底出在哪兒？癌癥的機(jī)理是什么？我們怎么去準(zhǔn)確地診療癌癥？怎么用藥物才能有效地治療癌癥呢？

▲ 宮頸癌海拉細(xì)胞

這是一張宮頸癌海拉細(xì)胞的圖片。海拉細(xì)胞實(shí)際上是研究細(xì)胞的一個(gè)“小白鼠”。這個(gè)細(xì)胞的尺度約為10微米。我們研究癌癥，不僅僅要看這個(gè)細(xì)胞的輪廓，還要看到它里面的這些紅絲，這些小綠點(diǎn)，這些代表的是細(xì)胞中蛋白質(zhì)等微細(xì)的結(jié)構(gòu)。

這些結(jié)構(gòu)的尺度一般在10納米左右，用常規(guī)的顯微鏡肯定無法看到。還有一件讓全世界都很惱火的事，就是全球人口正在逐漸老齡化。隨著人口老齡化的發(fā)生，老年疾病（學(xué)術(shù)名詞叫神經(jīng)退行性疾病）的患病人數(shù)也在大量增加。

▲ 阿爾茲海默癥患者大腦

這是一個(gè)阿爾茨海默病（俗稱老年癡呆癥）患者的大腦圖，這個(gè)大腦和正常人的大腦相比，已經(jīng)嚴(yán)重萎縮了。現(xiàn)在全世界都不知道阿爾茨海默病是如何發(fā)生的，衰老為何導(dǎo)致阿爾茨海默病患者發(fā)生如此大的變化。

要研究這個(gè)機(jī)理，我們要看清神經(jīng)元細(xì)胞，要了解它是怎樣的結(jié)構(gòu)，尤其更微細(xì)的結(jié)構(gòu)，以及神經(jīng)元細(xì)胞如何傳導(dǎo)信號(hào)這樣的一個(gè)過程。傳統(tǒng)顯微鏡顯然無法幫我們實(shí)現(xiàn)這些，所以我們就需要發(fā)明一種更高分辨率的顯微鏡，這就是“超高分辨熒光顯微鏡”。

探索微觀世界的“慧眼”

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有了這個(gè)超高分辨的熒光顯微鏡，我們就可以看清我們從來沒有見到的微觀世界。

我們每個(gè)人都去過醫(yī)院，都做過CT、核磁共振這樣的檢查。這類檢查的尺度只在器官或者組織水平。它的大小通常為幾微米或者幾毫米，像我們的血管、肺或者骨骼。

因?yàn)槲覀兊纳飳W(xué)家要看清病毒，要看清蛋白質(zhì)這樣尺度的微細(xì)結(jié)構(gòu)。辦法是有的，那就是用電子顯微鏡。電子顯微鏡和原子顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)以上要求。

但電子顯微鏡和原子顯微鏡都有一個(gè)最大的缺點(diǎn)——不能進(jìn)行活體細(xì)胞的觀測。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡顯微鏡可以克服這個(gè)缺點(diǎn)。

我們很小的時(shí)候就知道光學(xué)顯微鏡，然而實(shí)際上，用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡，我們只能看到200納米，也就是能分辨0.2微米這樣尺度的物體。

▲ 左：想要看到的，右實(shí)際看到的

光學(xué)顯微系統(tǒng)的成像原理：一個(gè)理想的物點(diǎn)經(jīng)過光學(xué)顯微系統(tǒng)之后，它會(huì)形成一個(gè)彌散的斑。就好像這只小貓，如果把它比喻成一個(gè)理想的物點(diǎn)，那么經(jīng)過顯微系統(tǒng)后，它就變得模糊了。

一個(gè)點(diǎn)是模糊的，兩個(gè)點(diǎn)經(jīng)過顯微系統(tǒng)之后依然是模糊的。像這幅圖，如果兩個(gè)點(diǎn)離得足夠遠(yuǎn)，我們?nèi)搜勰馨阉鼈兎智濉?/p>

如果兩個(gè)點(diǎn)離得足夠近，我們依然能把它們分清。那么這個(gè)時(shí)候，我們就認(rèn)為它達(dá)到了一個(gè)極限的水平，就像這幅圖。如果兩個(gè)點(diǎn)離得特別近，近到我們很難把它們分清楚，那么這時(shí)的極限距離是多少？

▲ 德國科學(xué)家阿貝 （1840～1905）：“魔咒”公式

1873年，德國一位叫恩思特·阿貝的偉大科學(xué)家通過嚴(yán)格的理論推導(dǎo)，給出了這個(gè)極限距離，用公式表達(dá)就是d=λ/2nSinα。

人們?yōu)榱思o(jì)念這位偉大的科學(xué)家，把這個(gè)公式刻到了他的墓碑上。

通過這個(gè)公式可以看出，如果我們在可見光波段，就是λ等于400納米的時(shí)候，n和Sinα都等于1的時(shí)候，這個(gè)光學(xué)顯微鏡的極限分辨率實(shí)際上只有λ/2，也就是只有200納米。

破解光學(xué)顯微系統(tǒng)的分辨率魔咒

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這個(gè)公式的發(fā)明確實(shí)解開了困擾科學(xué)家們多年的一個(gè)難題。“光學(xué)顯微系統(tǒng)能達(dá)到多少分辨率”這一難題就像魔咒一樣束縛了科學(xué)家的思維。人們一直想找到辦法破解這個(gè)魔咒，使顯微系統(tǒng)能夠看清更細(xì)微的物體。

▲ 威廉姆?莫爾納（William Moerner）：美國化學(xué)家

埃里克?白茲格（Eric Betzig）：美國應(yīng)用物理學(xué)家

斯蒂芬?黑爾（ Stefan Hell ）：德國物理學(xué)家

后來有三位科學(xué)家非常幸運(yùn)的破解了這一魔咒。他們就是發(fā)明了熒光顯微技術(shù)的三位科學(xué)家。為了紀(jì)念這三位科學(xué)家在超分辨顯微系統(tǒng)方面所做出的貢獻(xiàn)，2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)就頒給了他們，他們中有兩位是美國人，一位是德國人。

為什么頒的是化學(xué)獎(jiǎng)，而不是物理學(xué)獎(jiǎng)？難道光學(xué)顯微鏡是化學(xué)問題嗎？

人們都有這樣一種感覺，就是我們在一個(gè)黑暗的樹林里可以看到一群螢火蟲在飛舞，但如果想看一只螢火蟲飛舞就很難了。

▲ 熒光蛋白開關(guān)的方法

但是美國化學(xué)家莫納做到了。在生物界，他做到讓人們只看見一個(gè)熒光分子在閃亮。這是他很重要的一個(gè)貢獻(xiàn)，因?yàn)樗l(fā)明了熒光分子的開關(guān)技術(shù)。

當(dāng)一束高能的光照射到熒光分子的時(shí)候，熒光分子就亮了；再用別的照射它，又可以讓它熄滅，就像自己家的燈的開關(guān)一樣。

這項(xiàng)化學(xué)技術(shù)實(shí)際上是實(shí)現(xiàn)光學(xué)超分辨的核心之一，所以給他頒的是諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

▲ PLAM工作原理

受到莫納的啟發(fā)，美國的另一位科學(xué)家——白茲格，把單分子開關(guān)的技術(shù)應(yīng)用到了顯微系統(tǒng)上，發(fā)明了光激活定位顯微技術(shù)，簡稱PALM技術(shù)。

比如左邊這幅圖，每次每個(gè)圖都在閃爍，每次只看一個(gè)點(diǎn)，同時(shí)把它的位置記錄下來。通過很多幅這樣圖像的疊加之后，我就可以看到最右邊具備超分辨水平的圖了。

這就好比看銀河系的時(shí)候看不清，但如果每次只讓一顆星閃亮，等所有星星都分別成像以后，再把它們疊加起來，就可以看清整個(gè)銀河系了。

實(shí)際上白茲格是一個(gè)中國女婿。他是一個(gè)富二代，但他不想接手家族的企業(yè)，而是想追尋自己熱愛的顯微系統(tǒng)的研究。

▲ Eric Betzig在家搭建的超分辨顯微鏡

這張照片就是他在自己家客廳組裝的PALM顯微鏡。他的生活正應(yīng)了現(xiàn)在一句很流行的話：如果你不好好做科研，那么只好回家繼承百萬家產(chǎn)。

獲得這次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的還有德國科學(xué)家黑爾。他發(fā)明的技術(shù)實(shí)際上是受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)，簡稱STED。他和白茲格完全是兩類人。他是一個(gè)屌絲，為了喜愛的顯微鏡事業(yè)，他需要經(jīng)常到外面找科研經(jīng)費(fèi)。

▲ 受激發(fā)射損耗顯微技術(shù) STED

他也發(fā)明了一種獨(dú)特的辦法，就是用一束光去照明所有熒光分子的時(shí)候，這些熒光分子都會(huì)被點(diǎn)亮。這時(shí)候，用另一束像“甜甜面包圈”一樣的光，去熄滅這些熒光分子周圍的光，那么就會(huì)只剩下中間一點(diǎn)納米量級(jí)的分子的光，如此，我們就實(shí)現(xiàn)了超分辨。

受這兩位大師的啟發(fā)，現(xiàn)在的科學(xué)家也發(fā)明了很多其他的顯微系統(tǒng)。像干涉定位顯微系統(tǒng)，像結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)。這些系統(tǒng)都為科學(xué)界，為生物細(xì)胞研究，做出了巨大的貢獻(xiàn)。

獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家都非常聰明，而比他們更聰明的是一些商人。

▲ 顯微鏡壟斷：四大百年老店

他們的技術(shù)獲獎(jiǎng)了之后，世界四大顯微鏡生產(chǎn)企業(yè)——德國的蔡司、萊卡，日本的尼康、奧林巴斯，就把他們的技術(shù)買斷，然后將其變成了商品化的儀器。

現(xiàn)在全世界顯微鏡市場基本被這四家公司壟斷了。這四家公司都是百年公司，他們具有悠久的歷史。

中國顯微鏡現(xiàn)狀

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而我們中國的顯微鏡現(xiàn)狀又是怎么樣的呢？

中國的顯微鏡歷史并不短，有70年。中國第一家顯微鏡工廠是1943年在重慶成立的，后來搬到了江蘇南京，叫江南光儀廠。

這張圖是江南光儀廠當(dāng)時(shí)建廠時(shí)的照片。

這張是他們的廠房。

我國第一臺(tái)顯微鏡誕生于1953年，我們利用東德蔡司（“二戰(zhàn)”時(shí)，蔡司公司分成了西德和東德兩家）的圖紙?jiān)斐鰜砹宋覈谝慌_(tái)顯微鏡。但是，現(xiàn)在我國只能生產(chǎn)中、低端的顯微系統(tǒng)，高端顯微系統(tǒng)及其核心部件完全依靠進(jìn)口。

中國高端顯微系統(tǒng)雖然發(fā)展歷史不長，但我們絕不缺乏有世界眼光的科學(xué)家。2012年，中國科學(xué)院蘇州醫(yī)工所的所長唐玉國就率領(lǐng)團(tuán)隊(duì)開展了超分辨核心部件和系統(tǒng)的研究工作。

我是2014年有幸加入到這個(gè)團(tuán)隊(duì)的，我在這個(gè)團(tuán)隊(duì)里主要負(fù)責(zé)顯微物鏡的研發(fā)。顯微物鏡是顯微系統(tǒng)的一個(gè)核心部件，也可以說是最重要的部件。為什么呢？因?yàn)轱@微物鏡的數(shù)值孔徑，就是剛才阿貝公式下面那個(gè)nSinα，決定了整個(gè)顯微系統(tǒng)的物理分辨率。

這是我們研發(fā)的一個(gè)具有世界水平的物鏡。它的視場可以達(dá)到6毫米，分辨率可以到0.5微米，可用于我們腦神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)區(qū)域的拍攝。因?yàn)楹ｑR區(qū)很大，我們要看清楚的話，必須用這種大視場的物鏡系統(tǒng)去研究。

這個(gè)物鏡可以用于基因測序。

這張圖實(shí)際上是我國第一支NA1.45高數(shù)值孔徑顯微鏡。它就是我們超分辨系統(tǒng)用的最多的一個(gè)物鏡。這個(gè)物鏡雖然只有40毫米長，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。

▲ 光機(jī)設(shè)計(jì) 光機(jī)加工 裝配集成 像質(zhì)檢驗(yàn) 物鏡封裝

這張圖就是它的一個(gè)剖視圖。在40毫米長的范圍內(nèi)，有大約十幾片到二十幾片的小光學(xué)元件，其中有的小光學(xué)元件只有米粒般大小。

這個(gè)系統(tǒng)研制起來也非常艱難。除了光學(xué)材料、加工、鍍膜，最難的地方就是把所有的光學(xué)件和機(jī)械件集成起來。

因?yàn)槲覈壳斑€缺乏物鏡集成這方面的人才，我們的團(tuán)隊(duì)更缺乏有經(jīng)驗(yàn)的科研人員。后來，我們在全國所有的光學(xué)公司尋找這樣的人，終于在南京找到了一位老工人師傅，他有18年的物鏡裝配經(jīng)驗(yàn)。我們把他請到實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過一年的反復(fù)摸索，終于裝出了中國第一支NA1.45的顯微物鏡。

但是高興沒有多久，我們又犯了難。因?yàn)槔蠋煾笛b配物鏡只能靠他的經(jīng)驗(yàn)，靠他的手感，我們不能復(fù)制，也不能保證所有物鏡的質(zhì)量和效率都很好。為此，我們科研人員不得不一頭扎進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室，研發(fā)物鏡裝配的一體化系統(tǒng)。

現(xiàn)在我們已經(jīng)在這方面完全取得了突破，我們有自己標(biāo)準(zhǔn)化的、數(shù)字化的裝配流程和工藝。在物鏡研發(fā)過程當(dāng)中，團(tuán)隊(duì)成員經(jīng)常加班，經(jīng)常點(diǎn)外賣。

有時(shí)候外賣點(diǎn)的太多，外賣小哥送不過來，飯店老板就直接送過來了。所以我們研發(fā)物鏡不僅把中國的科研事業(yè)提到了一定的程度，打破了國外的壟斷，還帶動(dòng)了餐飲行業(yè)的發(fā)展。

▲ 雙光子-STED顯微鏡

令我印象最深刻的是研發(fā)這種雙光子-STED顯微系統(tǒng)，這是我國首創(chuàng)的顯微系統(tǒng)。它的研發(fā)難點(diǎn)主要在三激光合束。也就是要求三束激光的偏移誤差不能超過10納米。

這相當(dāng)于三艘宇宙飛船在浩渺的空間進(jìn)行準(zhǔn)確對(duì)接。為了攻克這個(gè)難關(guān)，科研人員一頭扎進(jìn)了暗室，不分白天黑夜地去做。有時(shí)候?qū)嶒?yàn)結(jié)束，拉開窗簾的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)外邊比屋里還要黑，因?yàn)橐呀?jīng)是半夜了。

▲ 四光束三維超分辨成像

我們不僅做了核心物件，搭建了系統(tǒng)，同時(shí)還研發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品。這是我們研發(fā)的一款四光束干涉的三維超分辨顯微系統(tǒng)。

這套系統(tǒng)的用處很多，可以做活細(xì)胞成像，可以做藥物研發(fā)。這樣的一臺(tái)設(shè)備，國外同類的產(chǎn)品要賣到500萬元人民幣，而我們的售價(jià)只有國外的三分之一。

▲ 人體上皮細(xì)胞三維成像

這張圖就是這套系統(tǒng)拍攝的人體上皮細(xì)胞的三維圖，這是這套系統(tǒng)拍攝的肝癌活細(xì)胞在肝癌靶向藥物的作用下被殺死的過程。

▲ 靶向藥物作用肝癌細(xì)胞

藍(lán)色的是細(xì)胞核，外邊一圈粉色的是細(xì)胞膜外包裹的藥物。這個(gè)藥物進(jìn)入到細(xì)胞里，然后把細(xì)胞殺死了。

有了這樣的系統(tǒng)，我們很高興，因?yàn)樗梢约铀傥覈伟┌邢蛩幬锏难邪l(fā)進(jìn)度，讓更多的癌癥患者得到及時(shí)的治療和康復(fù)。

我很自豪，因?yàn)槲覀冡t(yī)工所不僅做了核心部件，研發(fā)了系統(tǒng)，最重要的是，我們搭建了一個(gè)高精度超分辨顯微系統(tǒng)的研發(fā)平臺(tái)，這個(gè)平臺(tái)可以讓中國的生物學(xué)家、科學(xué)家定制自己的產(chǎn)品，做出世界領(lǐng)先的科研成果。同時(shí)我們的系統(tǒng)也賣到了美國、日本、以色列以及德國。

超分辨顯微系統(tǒng)的應(yīng)用

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超分辨顯微系統(tǒng)雖然誕生只有二十幾年，但是它在各方面起到的作用都是非常大的。尤其在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)上，可以說是引起了革命性的變化。

▲ 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡

展示一下超分辨顯微系統(tǒng)的魅力。這張圖是小白鼠大腦海馬區(qū)的一個(gè)超分辨顯微系統(tǒng)的觀測圖。這是常規(guī)系統(tǒng)拍攝的圖，實(shí)際一片模模糊糊。

▲ STORM

這是用超分辨顯微系統(tǒng)拍攝的同區(qū)域的圖，逐級(jí)放大很多之后，圖像依然很清晰。這張圖是用于阿爾茨海默病的研究的。

▲ SIM記錄的海馬神經(jīng)元絲狀偽足的運(yùn)動(dòng)

這也是一張用超分辨顯微系統(tǒng)拍攝的海馬區(qū)神經(jīng)元絲狀偽足運(yùn)動(dòng)的圖像。這種圖片可以讓我們知道人體是如何感受外邊的刺激，如何傳導(dǎo)信號(hào)的。

▲ 人體直腸癌組織切片

這是人體直腸癌組織切片的照片。左邊是共聚焦的圖，它最多只有200～300納米；右邊是它的囊泡里面蛋白質(zhì)分布的照片。它非常清楚。通過右邊的這些照片，我們的科學(xué)家可以進(jìn)一步闡述癌癥的發(fā)病機(jī)理。

▲ 人體宮頸癌細(xì)胞

這是人體宮頸癌細(xì)胞的一個(gè)圖片，細(xì)胞里不同的分子，不同的物質(zhì)都能夠分得很清楚，這對(duì)我們的科研有著很重要的意義。

▲ 小鼠大腦神經(jīng)元樹突

這是一個(gè)小鼠大腦神經(jīng)元的樹突，也可以看清我們?nèi)梭w是如何思考，如何在放電。

做了30年的科研工作，我的體會(huì)就是如果你認(rèn)準(zhǔn)一個(gè)目標(biāo)，就一定要堅(jiān)持做下去。

這就像剛才說到的那位美國科學(xué)家，他不去接手家族企業(yè)，而是堅(jiān)持做自己熱愛的研究，最終成為了一名諾貝爾獎(jiǎng)獲得者。正是因?yàn)樗恢眻?jiān)持超分辨顯微系統(tǒng)的研發(fā)，最終他才取得了成功。

另外，我們科研工作者有一個(gè)夢想，那就是讓我們的產(chǎn)品真正走向世界，讓全世界都用上我們中國制造的超分辨顯微系統(tǒng)。讓全世界的科學(xué)家找到癌癥的發(fā)病機(jī)理，找到阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理，研制出更多更好的藥物，服務(wù)于我們的健康。

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