抗體開發(fā)早期廣泛測量Fc介導效應(yīng)功能的重要性

引言

抗體治療領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，目前已有超過210種抗體獲批或處于監(jiān)管審查階段，約1250種抗體處于臨床開發(fā)中。抗體因其Fab（抗原結(jié)合區(qū)）和Fc（可結(jié)晶片段）兩個功能域的戰(zhàn)略性設(shè)計而成為高度通用的分子，可用于癌癥、自身免疫病、感染以及心血管、神經(jīng)、眼科和肌肉骨骼疾病等多種治療領(lǐng)域。

值得注意的是，在目前已上市或處于監(jiān)管審查的抗體治療藥物中，至少46%是經(jīng)過Fc工程化改造的；在晚期臨床研究階段的抗體中，這一比例也達到45%。這種工程化能力賦予抗體強大功能的同時，也帶來了重大責任。抗體設(shè)計的獨特特征會觸發(fā)一系列不同的Fc介導效應(yīng)功能，為避免在后期開發(fā)階段出現(xiàn)意料之外的安全性和有效性結(jié)果，必須在抗體開發(fā)過程的早期就系統(tǒng)性地測量抗體設(shè)計對Fc介導效應(yīng)功能的影響。鑒于抗體可部署的效應(yīng)功能范圍廣泛，且Fab與Fc功能域之間存在緊密的相互作用，使用一系列抗原特異性的生物物理和細胞介導的功能測定進行全面評估至關(guān)重要。

一、抗體與Fc受體

典型的抗體治療藥物包含兩個相同的Fab域和一個Fc域。Fc域通過與多種免疫細胞上表達的Fc受體以及補體成分C1q結(jié)合來介導效應(yīng)功能。在人類中，F(xiàn)cγR包括激活型受體（FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32a、FcγRIIC/CD32c、FcγRIIIa/CD16a）和抑制型受體FcγRIIb/CD32b。FcγRIIIb/CD16b通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上，缺乏直接的信號傳導結(jié)構(gòu)域，但可能與FcγRIIa或其他分子合作介導效應(yīng)功能。

此外，F(xiàn)c域還通過在內(nèi)皮細胞上與新生兒Fc受體結(jié)合來調(diào)節(jié)抗體的血清半衰期。IgG抗體在Fc CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297處有一個保守的N-糖基化位點，其糖型（如巖藻糖基化、半乳糖基化、唾液酸化）可精細調(diào)節(jié)IgG的效應(yīng)功能、補體激活和半衰期。抗體與表達不同水平激活型和抑制型FcR的多種免疫細胞相互作用，激活型與抑制型FcR的平衡以及抗體對這些受體的親和力對于調(diào)節(jié)抗體介導的效應(yīng)功能至關(guān)重要。

二、Fc介導的效應(yīng)功能

抗體Fc可參與的免疫細胞和分子種類繁多，因此抗體治療藥物可驅(qū)動多種直接和間接效應(yīng)功能。直接效應(yīng)功能主要包括補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬作用，以及針對病原體抗體的抗體依賴性黏液結(jié)合。間接效應(yīng)功能主要包括抗體依賴性細胞因子釋放和抗原呈遞。

ADCC：主要由自然殺傷細胞、粒細胞和髓系細胞介導。抗體通過Fab與靶細胞結(jié)合，通過Fc與效應(yīng)細胞上的激活型FcR結(jié)合，導致細胞毒性顆粒內(nèi)容物釋放，殺死靶細胞。

ADCP：主要由巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞等吞噬細胞介導，其他細胞如樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞也可介導ADCP。抗體調(diào)理靶細胞后，通過Fc與效應(yīng)細胞上的激活型FcR結(jié)合，導致靶細胞內(nèi)化和降解。

CDC：由靶細胞結(jié)合抗體的Fc域與六聚體球狀蛋白C1q結(jié)合啟動，觸發(fā)經(jīng)典補體級聯(lián)反應(yīng)，最終形成膜攻擊復合物，裂解靶細胞。抗體依賴性補體沉積也可通過吞噬細胞上的補體受體CR3促進吞噬作用。

間接功能：抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）可以FcR依賴性方式結(jié)合并內(nèi)化抗原-抗體免疫復合物，導致樹突狀細胞成熟、共刺激分子上調(diào)，并通過MHC I類和II類分子呈遞抗原，從而啟動CD4+和CD8+ T細胞介導的免疫應(yīng)答。抗體治療藥物還可以Fc依賴性方式促進多種細胞類型釋放促炎細胞因子，這可能間接支持抗體介導的殺傷作用，但也可能帶來安全風險。

鑒于Fc介導效應(yīng)功能的多樣性以及所涉及的細胞種類繁多，顯然，僅基于CDC、NK細胞介導的ADCC和單核/巨噬細胞介導的ADCP的臨床前評估是遠遠不夠的，必須使用更廣泛的測定組合進行全面分析。

-04-
三、抗體治療藥物設(shè)計的考量

Fc介導的效應(yīng)功能受到許多因素的影響，不僅涉及Fc域，還涉及抗體的Fab域。抗原結(jié)合、抗體結(jié)構(gòu)和靈活性取決于氨基酸序列、糖基化和電荷，并影響抗體對FcR和補體的親和力，進而影響抗體效應(yīng)功能、生物分布和安全性。

Fc設(shè)計

亞型選擇：目前上市的治療性抗體屬于IgG類，其中IgG1和IgG3在固定補體和結(jié)合激活型FcγR方面能力較強，而IgG2和IgG4能力較弱或無此能力。IgG1是設(shè)計用于介導ADCC、ADCP和CDC等效應(yīng)功能時的首選亞型。IgG2和IgG4通常用于設(shè)計不需要或旨在沉默F(xiàn)c效應(yīng)功能的抗體。其他同種型如IgA、IgE和IgM也正在被評估為治療藥物。

Fc蛋白工程：除同種型選擇外，F(xiàn)c域的蛋白工程可用于進一步微調(diào)抗體效應(yīng)功能、提高安全性和改善生物分布。引入針對FcR、C1q和FcRn結(jié)合域的點突變是調(diào)節(jié)Fc介導效應(yīng)功能最廣泛使用的技術(shù)。例如，對于具有細胞清除功能的抗體，可以引入點突變以增加對FcR的親和力，理想情況下使抗體結(jié)合偏向激活型受體，從而增強細胞介導的效應(yīng)功能。相反，激動劑抗體或旨在抑制B細胞活化的抗體，可以進行Fc工程化，使其結(jié)合親和力偏向抑制型受體FcγRIIb。抗體與FcγRIIb的結(jié)合可作為支架幫助聚集靶標受體并促進信號傳導，從而增強T細胞活化或誘導凋亡。然而，旨在增加對FcγRIIb親和力的點突變也可能增加對FcγRIIa的親和力，導致意外副作用。

另一種方法是創(chuàng)建抗體同種型雜交體，例如將IgG1的血清穩(wěn)定性和效應(yīng)功能特性與IgA觸發(fā)更強效ADCC的能力相結(jié)合。對于某些抗體（如檢查點抑制劑、阻斷配體/受體相互作用的抗體以及某些抗體-藥物偶聯(lián)物），F(xiàn)c效應(yīng)功能并非必需，有時去除效應(yīng)功能可提高療效和安全性。為此，可通過引入點突變或創(chuàng)建抗體同種型雜交體來降低或消除抗體與FcR的結(jié)合。Fc工程化也可用于增強抗體固定補體的能力，例如通過引入促進IgG六聚化的點突變或結(jié)構(gòu)域。此外，IgG抗體還可通過引入影響IgG與FcRn在低pH和/或中性pH下親和力的突變來進行工程化改造，以延長血清半衰期。這些突變及其組合的復雜結(jié)果必須通過結(jié)合疾病和免疫系統(tǒng)生物學設(shè)計的細胞效應(yīng)功能測定來經(jīng)驗性地確定。

Fc糖基化與糖工程：除了氨基酸序列，影響Fc受體親和力及效應(yīng)功能的另一個特征是抗體糖基化。巖藻糖缺失或減少的IgG對FcγRIIIa的親和力增加，并能觸發(fā)更強的ADCC。相反，末端唾液酸賦予IgG抗體抗炎特性。因此，在抗體發(fā)現(xiàn)過程中徹底分析糖基化可以揭示抗體介導的效應(yīng)功能類型。糖工程可用于去除或增強IgG效應(yīng)功能。例如，通過將Asn297替換為各種氨基酸來移除IgG1抗體上的糖基化位點，可以削弱其效應(yīng)功能。目前已有四種非糖基化治療性抗體獲批，一種處于監(jiān)管審查。通過從IgG聚糖結(jié)構(gòu)中去除巖藻糖可以增強效應(yīng)功能，這會導致與FcγRIIIa的結(jié)合增加，且不影響FcγRIIb，使抗體親和力偏向激活型受體。目前已有四種去巖藻糖化和三種低巖藻糖IgG治療藥物獲批。

Fab設(shè)計及Fab/Fc相互依賴性

Fab域負責抗體特異性。傳統(tǒng)的抗體治療藥物具有兩個相同的Fab片段，形成單特異性二價單體。Fab區(qū)和Fc區(qū)執(zhí)行不同的功能，但緊密相連，一方可以影響另一方的功能。Fc區(qū)可以影響Fab區(qū)對靶標的表觀親和力，并通過與特定FcR結(jié)合來提高某些中和抗體和激動劑抗體的功效。反之，F(xiàn)c介導的效應(yīng)功能也可能受到抗體親和力、親合力、形成免疫復合物的能力以及免疫復合物大小的影響。例如，一項針對CD4、EGFR或HER2的親和力調(diào)節(jié)抗體系列研究表明，具有中等親和力的抗體比高親和力抗體變體能夠觸發(fā)更強的效應(yīng)功能。研究人員認為，高親和力抗體較慢的解離速率促進了更多的二價結(jié)合，從而降低了靶細胞表面Fc域的密度，進而導致功能反應(yīng)減弱。相反，解離速率較快的抗體在飽和濃度下允許更高水平的單價結(jié)合，導致細胞表面調(diào)理作用增加，從而增強效應(yīng)功能。抗原的性質(zhì)、其在細胞表面的分布以及表位的位置對Fc介導的效應(yīng)功能也很重要。例如，ADCC和CDC對靠近細胞膜的表位更有效，而ADCP則要求表位與質(zhì)膜之間有一定的最小距離。IgG介導的CDC是Fab域影響Fc介導功能的另一個例子。單體IgG對C1q單個球狀頭的親和力較低，因此需要抗原驅(qū)動的IgG六聚化才能正確結(jié)合C1q并啟動補體級聯(lián)反應(yīng)。抗原驅(qū)動的六聚化高度依賴于抗體的靈活性、抗原的大小、密度、流動性以及表位位置。

幾十年來，F(xiàn)c和Fab區(qū)一直被認為是獨立作用的，因此在抗體治療開發(fā)的早期階段，重點主要放在優(yōu)化Fab區(qū)與靶抗原的結(jié)合上。對Fab-Fc緊密相互作用以及Fc介導功能在抗體安全性和有效性中作用的更好理解，凸顯了在抗體治療開發(fā)流程早期測量Fc介導功能的重要性。這有助于選擇在功效、安全性和生物分布方面最優(yōu)的Fab-Fc組合。這些測定應(yīng)提供用于篩選抗原特異性FcR、C1q和FcRn親和力的生物物理方法以及抗體糖基化譜分析，以及用于測量抗原特異性效應(yīng)功能的補體和細胞功能測定。重要的是，由于Fab和Fc區(qū)的密切關(guān)系，結(jié)合和功能測定都應(yīng)在抗原存在下進行，以全面了解抗體功能。換句話說，治療性抗體開發(fā)領(lǐng)域需要從評估二分體免疫復合物（FcR-抗體或抗體-抗原相互作用）發(fā)展到闡明三分體免疫復合物（FcR-抗體-抗原）的相互作用，以獲得生理相關(guān)和臨床相關(guān)的結(jié)果。

安全性考量

Fc域也涉及幾種潛在的治療性抗體副作用。根據(jù)治療目的，有些抗體不需要Fc介導的效應(yīng)功能，而對于某些抗體，F(xiàn)c結(jié)合FcR的能力可能會帶來安全風險。

ADC：抗體-藥物偶聯(lián)物通常不需要介導Fc效應(yīng)功能；相反，F(xiàn)cR的參與可能導致免疫細胞內(nèi)化ADC，從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。例如，曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物據(jù)報道以FcγRIIa依賴性方式被巨核細胞內(nèi)化，導致血小板減少癥。因此，在開發(fā)新型ADC時，應(yīng)徹底評估FcR親和力和脫靶細胞毒性的實際消除情況。

ADE：FcR的參與也可能導致感染或疾病的抗體依賴性增強，即抗體即使在沒有病毒受體表達的細胞上也能促進病毒進入細胞。通過Fc工程消除FcR親和力可以預防ADE，這一策略最近已用于抗SARS-CoV-2抗體。目前有一種獲批的抗SARS-CoV-2抗體被設(shè)計為效應(yīng)功能降低。

CRS：抗體治療藥物最危險的副作用之一是細胞因子釋放綜合征，當細胞因子過度釋放導致內(nèi)皮損傷和多器官衰竭時就會發(fā)生。在人體中引發(fā)CRS的抗體包括抗CD3 muromonab、抗CD52 alemtuzumab、抗CD28 TGN1412，以及在少數(shù)情況下的抗CD20 rituximab。對于這些抗體，CRS已被證明是Fc介導的，要么通過結(jié)合NK細胞上的FcγRIIIa（alemtuzumab），要么通過結(jié)合FcγRIIb并將其作為支架以更好地聚集靶標受體（TGN1412）。TGN1412的故事清楚地表明，廣泛評估抗體設(shè)計對FcR結(jié)合以及所需和不需要的Fc介導效應(yīng)功能的影響是多么關(guān)鍵。

如上所述，F(xiàn)c修飾的影響取決于抗體靶點和治療背景，F(xiàn)c設(shè)計對FcR結(jié)合和抗體效應(yīng)功能的影響需要在抗體治療開發(fā)的早期階段進行系統(tǒng)篩選，以避免在臨床上出現(xiàn)意外且有時非常嚴重的后果。特別是當抗體被設(shè)計為不具有效應(yīng)功能時，應(yīng)使用多種免疫細胞類型的測定組合徹底評估Fc介導功能的沉默，而不僅僅是經(jīng)典的三種測定（NK介導的ADCC、單核細胞介導的ADCP和CDC）。功能篩選還應(yīng)輔以一系列生物物理測定，例如糖基化譜分析以及抗原特異性FcR和C1q結(jié)合測定。

-05-

結(jié)語

抗體工程技術(shù)的進步，以及對抗體效應(yīng)功能和疾病生物學所涉及機制的更深入理解，促使生物制藥行業(yè)致力于新的抗體靶點、新形式，并利用抗體工程來微調(diào)抗體功能。這些抗體發(fā)現(xiàn)方面的新進展可能使抗體能夠根據(jù)疾病進行定制。然而，要充分利用如此強大的工具，必須考慮幾個因素。在過去十年中，人們越來越接受Fab和Fc之間的密切關(guān)系，以及抗體設(shè)計對Fc介導效應(yīng)功能、生物分布和安全性的影響，這些需要在下一代治療性抗體的發(fā)現(xiàn)過程中加以考慮和實施。創(chuàng)新的抗體發(fā)現(xiàn)浪潮與可能的抗體效應(yīng)功能及其安全影響的多樣性，凸顯了在抗體治療開發(fā)流程早期需要廣泛而系統(tǒng)地進行Fc效應(yīng)功能分析。

監(jiān)管機構(gòu)對評估Fc介導效應(yīng)功能的指導主要限于三種測定：NK介導的ADCC、單核細胞介導的ADCP和CDC。然而，我們期望通過對更廣泛的高通量生物物理和細胞測定進行更全面的臨床前評估來改進Fc介導效應(yīng)功能的評估，這些測定應(yīng)在靶抗原存在下進行，即三分體免疫復合物。這樣的廣泛評估既能在后期更昂貴的開發(fā)步驟中降低風險，又能為解決監(jiān)管機構(gòu)的額外問題提供基礎(chǔ)。

抗體一直是并將繼續(xù)在可預見的未來成為治療干預最強大的模式之一。與任何尖端領(lǐng)域一樣，治療性抗體也面臨著自身特定的挑戰(zhàn)。我們面臨的每一個挑戰(zhàn)都是成長的機會。整個領(lǐng)域應(yīng)該認識到，能力越大，責任越大，機遇也越大。

參考資料：

With great power, comes great responsibility: the importance of broadly measuring Fc-mediated effector function early in the antibody development process.MAbs. 2025 Dec;17(1):2453515.

公眾號已建立“小藥說藥專業(yè)交流群”微信行業(yè)交流群以及讀者交流群，掃描下方小編二維碼加入，入行業(yè)群請主動告知姓名、工作單位和職務(wù)。