FSHW | 3D生物打印中卵白蛋白/明膠生物墨水的制備及其在培養肉原位組織培養中的應用

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Abstract

3D生物打印是一項新興的組織工程技術，其打印參數已得到升級優化，能夠在細胞培養肉領域實現深度應用。然而，目前迫切需要開發適用于細胞培養肉的、兼具優異可打印性與可食用性的生物墨水。為此，本研究開發了一種以卵白蛋白和明膠為基礎的低成本生物墨水。首先，通過流變學分析確定該生物墨水具備適宜的可打印性；同時，借助吸水率測試與降解速率測試，證實了由該生物墨水打印形成的支架具有出色的機械穩定性。其次，通過細胞增殖培養、細胞狀態研究以及組學分析，明確了該支架的生物相容性及其與細胞間的相互作用機制。值得注意的是，AG7展現出更優的可打印性，而AGS7則為細胞黏附、增殖與遷移提供了更有利的微環境。S型指數生長曲線進一步表明，AGS7支架在細胞培養方面具有顯著優勢。更為重要的是，本研究將肌肉細胞的組織培養過程模擬拓展至類器官培養層面，闡明了細胞與支架之間相互作用的關鍵信息。該研究成果填補了行業內相關領域的空白，為細胞培養肉的產業化生產開發提供了一種全新策略。

Introduction

細胞培養肉，又稱生物培養肉，是近年來興起的一種顛覆性肉類生產技術。目前，大多數培養肉以肉餡形式存在，業界普遍認為，采用組織工程技術構建3D肌肉組織或將成為解決這一問題的理想方案。3D生物打印作為一種通用工程技術，可用于制備具有特定結構和形狀的3D構建體。通過計算機輔助設計，能夠精準控制細胞與生物材料的排布位置，進而逐層快速構建出與天然組織相似的人工組織結構。盡管3D生物打印技術在人工組織構建領域展現出廣闊前景，但其生物墨水存在的可打印性差、可食用性不佳等問題，卻限制了該技術在細胞培養肉領域的應用——這些問題易導致構建體結構不穩定，并帶來生物安全性風險。此外，細胞的黏附、增殖及遷移效果也與生物墨水的性能密切相關。因此，開發具備優異可打印性與生物相容性的生物墨水，對于構建理想的3D肌肉組織至關重要。

根據近期部分研究，卵白蛋白是一種可食用且成本低廉的生物大分子。因其含有卵清蛋白、卵轉鐵蛋白、卵類黏蛋白等多種成分，有助于細胞黏附與增殖，進而可提升所制備支架的整體生物相容性，并促進細胞增殖與黏附。因此，卵白蛋白可被視為制備生物墨水的潛在可用材料。然而，由于卵白蛋白含水量高且化學性質不穩定，其自身不具備可打印性，需與其他成分復配使用。明膠是一類已知的大分子親水性膠體，由膠原蛋白部分水解制得。憑借適宜的流變特性與優異的生物相容性，明膠被廣泛應用于基于擠出成型的3D生物打印中，用于制備細胞支架。但遺憾的是，明膠具有溫度敏感性相變特性：當溫度升至25～35 ℃時，明膠易從凝膠態轉變為溶液態。這種特性對支架的結構穩定性保持構成了重大挑戰。因此，通過物理或化學方法對明膠基支架進行交聯處理以提升其穩定性，是十分必要的。

圖1 （A）卵白蛋白/明膠墨水的制備及三維支架打印與交聯流程示意圖；（B）不同墨水的流變學特性；（C）三維打印支架的掃描電鏡圖像

本研究中，如圖1A所示，通過將明膠溶液與卵白蛋白混合，制備出一種新型復合生物墨水，并利用3D打印技術構建了支架。打印完成后，研究采用低濃度戊二醛進行支架固化：戊二醛可與（支架材料中）賴氨酸和羥賴氨酸殘基的ε-氨基發生反應，形成席夫堿，進而進一步提升支架的穩定性。研究通過流變學分析評估該生物墨水的適宜可打印性，具體分析指標包括儲能模量（G’）、損耗模量（G”）及剪切變稀行為；同時，通過可打印性測試進一步驗證了生物墨水的打印性能。此外，借助吸水率測試與降解速率測試，對支架的機械穩定性進行了評估。最后，為將該支架應用于肌肉細胞的組織培養，研究通過細胞增殖培養、細胞狀態分析及組學分析，系統評估了支架的生物相容性及其與細胞間的相互作用。本研究為利用3D生物打印支架生產細胞培養肉提供了一種新方法。

Results and Discussion

生物墨水的流變學分析

為制備可用于打印的生物墨水，本研究將從新鮮雞蛋中提取的純卵白蛋白與不同濃度（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%）的明膠溶液混合攪拌，得到均一液態的混合物，用于后續表征實驗。

首先，通過流變學分析對所制備生物墨水的流變特性進行評估。如圖1B1所示，當剪切速率從0.1 s?1增至100 s?1時，所有生物墨水的黏度均呈下降趨勢，表現出典型的剪切變稀特性。此外，隨著明膠含量的增加，生物墨水的黏度顯著升高。

如圖1B2和B3所示，所有生物墨水的儲能模量與損耗模量均在4～40 ℃的溫度范圍內進行了表征。在整個測試溫度區間內，所有生物墨水的儲能模量均持續高于損耗模量，這表明生物墨水始終維持著穩定的類凝膠狀態。此外，值得注意的是，AG5、AG7和AG10的儲能模量在約15 ℃時出現顯著下降，這一現象歸因于溫度升高導致明膠分子間氫鍵作用減弱。該結果表明，更高濃度的明膠有助于提升生物墨水的穩定性。

3D打印支架的制備與表征

通過流變學分析，已證實所制備生物墨水具備剪切變稀特性與機械穩定性。隨后，研究將該生物墨水用于3D打印以構建支架。具體流程如下：將制備好的生物墨水裝入注射器中進行3D打印，同時加入低濃度戊二醛溶液（0.25%）進行交聯處理，最終成功制備出AGS2、AGS5、AGS7 和 AGS10 系列支架，用于后續表征實驗。

本研究采用掃描電鏡對所有支架的表面及內部形貌進行表征分析。如圖1C所示，經戊二醛交聯后，所有支架的表面形貌均呈現出穩定的單層片狀結構，且支架內部具有多孔結構。通過測量可知，隨著明膠含量的增加，支架內部孔徑顯著減小。

圖2 采用不同墨水進行三維打印，并評估三維打印支架的力學性能

如圖2A所示，研究人員采用多種生物墨水，通過基于擠出成型的3D打印機構建3D結構。如圖2B所示，隨著明膠含量的增加，打印結構的Pr值從0.76逐步升高至1.19。值得注意的是，AGS7的Pr值接近1，這表明明膠在一定程度上對提升可打印性具有積極作用。

如圖2C所示，生物墨水打印絲束的厚度先降低后升高。其中，AG7表現出更低的厚度分布差異，且其絲束厚度更接近打印頭直徑，這有利于實現均勻擠出并獲得更高的打印質量。綜上，結果表明AG7生物墨水具有更優異的打印性能，且適當增加明膠含量對提升生物墨水的可打印性與均勻性具有積極影響。

如圖2D所示，所有支架均表現出顯著的吸水能力。其中，AGS2支架的溶脹率最高，AGS10支架的溶脹率最低，這一差異主要歸因于二者內部孔徑的不同。

如圖2E所示，研究人員對各支架在磷酸鹽緩沖液中的降解性能展開了測試：在初始5～10 d內，由于支架基質中未交聯的明膠與卵白蛋白發生溶解，所有支架均呈現出加速降解的特征；而在10～40 d期間，其質量損失速率逐漸減緩。值得注意的是，在磷酸鹽緩沖液中培養至40 d時，AGS2支架的結構完整性損失最大，AGS10支架的結構完整性損失最小。上述結果表明，高濃度明膠溶液更易與戊二醛發生交聯反應。如圖2F所示，研究發現吸水能力與明膠濃度的升高呈顯著負相關（相關系數為-0.97），而打印性能與明膠濃度的升高呈顯著正相關（相關系數為0.97）。同時可觀察到，兩條相關性曲線均呈線性，這進一步表明：隨著明膠濃度的增加，支架的吸水能力下降，而生物墨水的打印性能提升。

成肌細胞生物打印與細胞培養

研究人員選取AGS5、AGS7和AGS10三種生物墨水開展進一步的成肌細胞打印研究。為評估3D生物打印支架的生物相容性，研究人員觀察了支架培養7 d后的活/死細胞染色結果，并采用CCK-8法監測了第1天至第7天的細胞增殖情況。如圖3A所示，所有支架均表現出優異的生物相容性，活細胞比例接近98%。尤為重要的是，與AGS10相比，AGS5和AGS7支架內的細胞分布更均勻，且這兩組支架中的細胞在形態上呈現出更明顯的梭形。此外，AGS7支架內的細胞數量顯著多于AGS5。AGS5、AGS7和AGS10的細胞增殖曲線結果顯示：AGS5與AGS10的增殖曲線（分別呈線性和拋物線形）均低于正常細胞增殖曲線，而AGS7的增殖曲線則與正常細胞增殖曲線一致；同時，第7天的細胞增殖結果表明，AGS7的細胞數量顯著多于AGS5和AGS10，這進一步證實：與AGS5、AGS10相比，AGS7可促進細胞增殖。綜上，AGS7支架在保持較高持水力的同時，具有更低的降解速率。這意味著AGS7既能保留更多細胞黏附位點，又能維持高效的營養物質與氧氣交換，對細胞在支架內的黏附、增殖及遷移均具有積極作用。

如圖3B所示，培養第1天的結果顯示，AGS5和AGS7的細胞貼壁效率顯著高于AGS10。且通過分析細胞倍增時間發現，AGS5和AGS7在培養第3天實現細胞倍增，并于第4天進入細胞增殖的指數生長期，這一趨勢與正常細胞增殖曲線一致。與之相反，AGS10在整個細胞增殖周期內均偏離正常細胞增殖曲線，不利于后期細胞的持續培養。值得注意的是，AGS5的線性增殖曲線在第4天出現線性偏離，這表明在增殖過程中，細胞遷移與再聚集受到材料的限制。綜上，通過研究不同材料比例下的細胞貼壁與增殖情況，本研究進一步闡明了在細胞持續培養過程中，AGS7在細胞貼壁、細胞遷移、細胞增殖及細胞營養物質交換方面所具備的優勢?；谏鲜鼋Y果，研究人員選擇由AG7墨水制備的支架作為后續3D組織培養所用的支架。

圖3 采用不同墨水打印的各類支架及成肌細胞的生物相容性測試

3D生物打印支架的組織培養

如圖4A所示，將上述制備的AG7墨水與成肌細胞混合，制備得到細胞濃度為1×10? cells/mL的生物墨水，用于3D生物打印。在支架培養過程中，研究人員通過熒光顯微鏡（培養1～7 d）和顯微鏡觀察（培養1～15 d），進一步分析細胞行為及增殖狀態。

如圖4B所示，支架內的細胞表現出良好的增殖能力：初始細胞貼壁后，先在支架邊緣附近增殖。培養至第7天，細胞已完全覆蓋整個支架，且分布均勻，這進一步表明該支架不僅具有良好的生物相容性，還對細胞貼壁與遷移無顯著不良影響。此外，在所有時間節點的觀察中，支架內均未發現明顯死細胞，提示低濃度戊二醛短期交聯處理對細胞狀態無顯著影響。

如圖4C所示，對單位面積細胞數量的分析結果顯示：支架內細胞在培養第3天后進入增殖指數生長期，第7天時單位面積細胞數量達到562 cells/mm2。

如圖4D所示，支架內細胞在培養前7天快速增殖，這一結果與前述結論一致。值得注意的是，當細胞持續增殖至第9天時，支架內部空間被細胞填滿，細胞增殖受到支架空間限制，開始向支架外部溢出。此外，細胞通過細胞間連接在支架孔隙邊緣遷移并增殖：第11天時，孔隙邊緣的細胞連接形成線狀細胞簇；第13天時，支架孔隙邊緣的細胞開始沿周邊方向鋪展增殖，以線狀細胞簇為基礎形成開放的膜狀細胞組織；第15天時，支架孔隙內形成完全閉合的膜狀細胞組織。

如圖4E所示，在細胞培養至第9天前，支架孔隙邊緣幾乎未出現膜狀細胞組織；第11～15天期間，膜狀細胞組織的形成速度加快，其面積增幅約為75%。由此可見，支架內細胞的生長過程可分為三個階段：早期大量增殖并遷移；中期在支架孔隙內以點狀和線狀形式增殖；最終在支架孔隙內完成膜狀細胞組織的形成。

圖4 膜狀細胞組織的培養過程

2D與3D細胞培養的差異

3D生物打印完成后，支架內細胞的增殖與遷移速度加快。在支架周邊區域，細胞展現出旺盛的增殖與遷移能力，最終在孔隙區域形成呈線性排列的細胞簇。這些線性排列的細胞逐漸擴張并相互連接，最終形成閉合的膜狀細胞組織結構。顯微鏡觀察進一步驗證了這一過程。轉錄組測序分析顯示，2D細胞培養與3D細胞培養存在明顯差異，二者相關系數為0.374。差異基因分析表明，兩種培養方式間存在3559個差異表達基因。韋恩圖分析進一步揭示了2D與3D細胞培養中基因表達的重疊模式與獨特模式。為深入探究2D與3D細胞培養的差異，研究人員對兩類樣本的數據進行分組，并對差異基因表達情況開展對比分析。利用兩種培養方式的數據進行基因聚類熱圖分析（圖5A），結果顯示出不同的基因表達譜。

如圖5B所示，基因本體（GO）分析結果表明，與細胞黏附、遷移、增殖及細胞組織構建相關的多種生物學過程、細胞組分及分子功能顯著富集。其中，鈣離子結合、細胞外基質結合、細胞表面、細胞黏附、細胞外基質結構成分及生長因子活性在這些生物學過程中發揮關鍵作用。在這些功能相關的差異表達基因中，顯著上調的基因包括Ltbp2、Olfml2b、Fbln2、Nid2、Col3a1、Bmp4、Fgf7、Inhbb、Lama4、Csta、Gpnmb、Nfasc、Npy2r、Bmp7、Megf10、Cdh20、Clstn2、Bnc1、Dsg2等。因此，研究推測，3D打印支架材料可在細胞黏附與增殖過程中促進這些基因的表達，進而改善細胞黏附與增殖效果。富集結果中，“通過質膜黏附分子實現的同源細胞黏附”及“橋粒組裝”的主要功能是：借助質膜上相同的黏附分子實現細胞附著，并促進細胞間黏附及細胞連接的形成。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析結果顯示，黏著斑通路與細胞周期信號通路顯著富集。

如圖5C所示，黏著斑通路中富集了68個調控基因，肌動蛋白細胞骨架調控通路中富集了59個基因，細胞周期通路中富集了43個基因，緊密連接通路中富集了33個基因，細胞黏附分子通路中富集了54個基因，鈣信號通路中富集了57個基因。

如圖5D所示，兩種培養方式間的主要差異表達基因包括Abi3bp、Cd36、Gpnmb、Apoa1、Ly6e、Csta、Rln1、Loc430862和Hps5。

如圖5E所示，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）結果顯示，Ltbp2、Nid2、Bmp4、Pax7、Myod和Myog基因在3D細胞培養中表達量更高。這表明，3D培養可促進關鍵基因的表達，從而對細胞增殖、黏附及細胞組織結構的形成產生積極影響，該結果與轉錄組分析結果一致。

如圖5F所示，3D支架培養后期的免疫熒光結果顯示，細胞已完全覆蓋整個支架，且在支架孔隙內形成了具有細胞間連接的多層膜狀細胞組織。

如圖5G所示，將支架內細胞生長過程分為三個階段：第一階段為生物打印完成后細胞在支架內的附著階段；中期為細胞在支架內的增殖階段；后期為支架孔隙內膜狀細胞組織的形成階段。qRT-PCR結果顯示，影響細胞黏附及組織形成的基因（Cdh20、Dsg2和Megf10）表達均顯著增強。值得注意的是，Cdh20基因持續高表達，而Dsg2和Megf10基因僅在培養后期表達量顯著升高。

PCR結果顯示，在培養后期，支架內Pax7和Myod基因的表達水平顯著高于早期，這也證明細胞在組織結構形成后期并未停止分裂，而是在支架孔隙內持續增殖，進而形成多層膜狀細胞組織。支架培養后期Fgf7基因的高表達同樣表明，此階段細胞仍未停止增殖。

如圖5H所示，蛋白質印跡結果顯示，與培養早期相比，后期PAX7和MYOD蛋白的表達量顯著增加。因此，培養后期PAX7和MYOD的相對高表達表明，支架內細胞的增殖行為尚未停止，同時細胞可能正在為分化及肌肉組織形成做準備，這與基因表達結果及轉錄組分析結果一致。綜上，以卵白蛋白和明膠為主要成分的生物墨水不僅具有良好的生物相容性，還能積極調控支架內細胞中與黏附、增殖相關的關鍵基因的表達，并誘導膜狀細胞組織的形成，表明其在培養肉細胞組織構建支架領域具有潛在應用價值。

圖5 二維與三維細胞培養的差異

支架懸浮培養與貼壁培養

本研究開展了支架貼壁培養與支架懸浮培養相關實驗。研究人員對兩種培養方式的樣本數據進行分析，并開展差異基因對比分析。

如圖6A所示，基于兩種培養方式的數據進行基因聚類熱圖分析，結果顯示出不同的差異表達基因。如圖6B所示，基因本體分析結果中主要富集的功能包括細胞外空間、微管馬達活性、微管結合、驅動蛋白復合物及含膠原蛋白的細胞外基質。這些功能在維持細胞形態、細胞運動、細胞內物質運輸及細胞黏附等多種生物學過程中發揮作用。這可能表明，懸浮培養樣本在細胞外基質組成與相互作用、細胞信號傳導及細胞外環境方面與貼壁培養存在顯著差異。

如圖6C所示，KEGG富集結果顯示在黏著斑、細胞周期、甲狀腺激素信號通路、范可尼等顯著富集。

如圖6D所示，兩種培養方式間的差異基因包括Lgr5、Col9a、Map3k8、Fgf16、Nog、Cdk1、Ttk、Aaed1、Rcan2、Fancb、Fancf、Brca2等。由此可見，與支架貼壁培養相比，懸浮培養的細胞增殖周期更短，能夠更早進入組織培養后期階段，且懸浮培養的細胞可能表現出更強的分化潛能。

如圖6E所示，qRT-PCR結果顯示，Cdk1和Ttk基因在培養中期表達量顯著升高，在后期表達量下降；而Lgr5和Map3k8基因在整個培養過程中均維持高表達。這表明，懸浮支架中的細胞在形成膜狀細胞組織之前，有絲分裂活動更為活躍。后期Cdk1和Ttk基因的低表達也提示，懸浮培養可能更早進入組織培養后期階段。因此，Wnt/MAPK信號通路活性相對較高的懸浮培養細胞，更易發生細胞分化。綜上，為更好地模擬體內細胞生長環境，并嘗試突破傳統貼壁培養的局限性，本研究對支架懸浮培養進行了初步探索。結果表明，兩種培養方式在細胞增殖、附著、運動及分化方面存在顯著差異，尤其是在細胞增殖與分化方面的差異，將成為未來研究的重點方向。

圖6 支架懸浮培養與貼壁培養的差異

Conclusion

綜上所述，為制備適用于細胞培養肉組織的可打印生物墨水，本研究開發了以卵白蛋白和明膠為原料的新型生物墨水，并成功制備出3D打印支架，同時對支架的形態、吸水性、打印性能、降解性及生物相容性進行了表征。其中，AG7生物墨水展現出更優異的可打印性；與此同時，S型指數生長曲線進一步表明AGS7支架在細胞培養方面具有顯著優勢。細胞培養結果顯示，成肌細胞在該支架內可實現有效的黏附、增殖與遷移。更重要的是，通過3D細胞培養，研究成功構建出類似類器官培養的肌肉細胞組織。此外，轉錄組學、qRT-PCR及Western blot分析結果表明，2D培養與3D培養在細胞附著、增殖及遷移過程中存在明顯差異；同時發現，3D培養可促進與細胞間連接相關的基因（Cdh20、Dsg2、Megf10）的表達，進而助力細胞組織的形成。總體而言，本研究為培養肉制造提供了一種新方法的可能性，表明3D細胞培養在細胞培養肉領域具有巨大的應用潛力。

Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for in situ tissue culture of cultured meat

Xiang Guoa,b, Feng Yanga, Yu Qia, Yingying Lia, Shouwei Wanga,*, Baohua Kongb,*

a China Meat Research Center, Beijing 100068, China

b College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

*Corresponding author.

Abstract

Three-dimensional (3D) bio-printing is an emerging tissue engineering technology, and its printing parameters have been upgraded to enable in-depth application in cell-cultured meat. However, excellent printable and edible bio-inks for cell-cultured meat are in urgent need of development. Therefore, a low-cost bio-ink based on albumin and gelatin was developed. At first, suitable printability of the bio-ink was determined by rheology analysis, excellent mechanical stability, and excellent mechanical stability of the printed scaffold was also proved by water absorption and degradation rate. Next, the biocompatibility of the scaffold and its interaction with cells were clarified through cell proliferation culture, cell status research and omics analysis. Notably, AG7 demonstrated better printability and AGS7 provided better conditions for cell attachment, proliferation and migration, S-shaped exponential growth curve further revealed the significant advantages of AGS7 scaffolds in cell culture. More importantly, the tissue culture process of muscle cells was simulated to organoid culture, which elucidated the interaction information between cells and scaffolds. This work has filled the vacancy in the industry and provides a novel strategy for the development of production of cell cultured meat.

Reference:

GUO X, YANG F, QI Y, et al. Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for

in situ

翻譯： 王立磊（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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