FSHW | 果膠低聚糖糖基化修飾通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)和Th1/Th2免疫平衡來降低蝦原肌球蛋白的致敏

本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請授權(quán)。

Introduction

南美白對蝦因其細(xì)膩的風(fēng)味和全面的營養(yǎng)成分而成為世界各地流行的海鮮。然而，蝦被歸類為“八大”食物過敏原之一。南美白對蝦是一種常見的過敏性食物，在食品法典委員會(huì)和許多國家的食品標(biāo)簽上都顯示在。對南美白對菌過敏的患者即使因少量蝦而面臨風(fēng)險(xiǎn)，過敏反應(yīng)可引起與運(yùn)動(dòng)引起的過敏反應(yīng)一樣嚴(yán)重的癥狀。事實(shí)上，全球超過2.5%的人口對原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌漿鈣結(jié)合蛋白（SCP）等蝦蛋白有IgE介導(dǎo)的I型過敏反應(yīng)。分子量為31～42 kDa的TM是南美白對蝦的主要過敏原，南美白對蝦是一種酸性糖蛋白，對蛋白酶、酸和熱處理具有良好的穩(wěn)定性。TM具有高度保守的氨基酸序列，72%～98%的患者在純化的TM中表現(xiàn)出陽性IgE反應(yīng)。通過食品加工降低過敏性是減少TM過敏原的適當(dāng)方法，但如今理想的加工方法有限。

降低蝦類食物過敏原致敏性的方法通常包括物理處理（如加熱、微波、高強(qiáng)度超聲、超高壓、輻照）和糖基化反應(yīng)等。糖基化修飾因具有位點(diǎn)特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，已成為食品過敏領(lǐng)域中改變蛋白質(zhì)功能特性的潛在方法。研究表明，核糖、殼寡糖等還原糖與中國對蝦TM的糖基化反應(yīng)可使后者致敏性降低高達(dá)60%。糖基化修飾可降低α-乳清蛋白的致敏活性并改變其多級(jí)結(jié)構(gòu)。除葡萄糖、核糖等常用單糖外，低聚半乳糖（GOS）、殼寡糖（COS）、果膠寡糖（POS）等寡糖也被用于降低蛋白質(zhì)致敏性。其中，低聚半乳糖可通過影響Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，調(diào)控蝦TM誘導(dǎo)的食物過敏。也有研究提出利用低聚半乳糖和低聚果糖（FOS）降低雞卵類粘蛋白（OVM）致敏性的方法。

研究發(fā)現(xiàn)，果膠寡糖作為益生元，可通過誘導(dǎo)免疫相關(guān)因子調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而預(yù)防和減輕過敏反應(yīng)。迄今為止，利用果膠寡糖對TM進(jìn)行糖基化修飾以降低其致敏性的研究相對較少。因此，本研究從凡納濱對蝦中提取并鑒定過敏原蛋白TM，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并預(yù)測抗原表位；隨后采用低聚半乳糖醛酸（GA）對TM進(jìn)行糖基化修飾，檢測其體外IgE結(jié)合能力；同時(shí)構(gòu)建BALB/c小鼠糖基化修飾TM過敏模型，探究其抗過敏效果及作用機(jī)制。

Results and Discussion

TM的純化和鑒定

南美白對蝦蛋白經(jīng)過熱處理、等電沉淀、硫酸銨沉淀和透析脫鹽后的純化情況如圖1A所示，結(jié)果表明，高度純化的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上顯示為分子量約為35 kDa的單條帶。蝦TM的分子量為32～38 kDa，因此推測該條帶為TM。該方法純化的TM收率約為3.41 mg/g。此外，肽片段是在用胰蛋白酶消化純化的蛋白質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的。通過質(zhì)譜/質(zhì)譜（MS/MS）進(jìn)一步分析有效峰。共有26種肽匹配不同的蛋白質(zhì)。匹配的肽與來自Lit v 1 TM、肌球蛋白重鏈1型和肌球蛋白重鏈2型的比對氨基酸序列具有89.4%、22.9%和23.2%的同一性，分?jǐn)?shù)匹配超過90。Lit v 1 TM的氨基酸序列如圖1B所示。在284個(gè)氨基酸中，28個(gè)賴氨酸（K）和21個(gè)精氨酸（R）具有潛在的糖基化位點(diǎn)。TM的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1C所示。兩種分析都表明，Lit v 1 TM的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖1 南美白對蝦TM的SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

原肌球蛋白的糖基化程度

分子量變化可用于反映糖基化程度。與TM（圖2A）相比，糖基化后，GA-TM具有更高的分子量（GA-TM＞DGA-TM＞DH-TM＞TM）。游離氨基含量和碳水化合物含量的改變是反映糖基化程度的重要標(biāo)志物。如數(shù)據(jù)所示（圖2B），TM的游離氨基含量最高，與之前報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。與TM相比，GA-TM的游離氨基含量降低（TM＞DH-TM＞DGA-TM＞GA-TM）（圖2B）。用于評(píng)估糖基化反應(yīng)進(jìn)展的碳水化合物含量，如數(shù)據(jù)所示（圖2C）。DGA-TM導(dǎo)致TM上的糖基化程度高于GA-TM（DGA-TM＞GA-TM＞TM＞DH-TM）。這可能是因?yàn)镈GA-TM的聚糖幾乎是GA-TM的兩倍，導(dǎo)致碳水化合物含量更高。據(jù)報(bào)道，AGE可以作為有效的表位發(fā)揮作用并增加食物過敏的風(fēng)險(xiǎn)。如圖2D所示，與TM相比，糖基化TM的AGEs含量顯著更高（GA-TM＞DGA-TM＞TM＞DH-TM），因此表明高聚合度（DGA-TM）比低聚合度（GA-TM）對AGEs的產(chǎn)生有更少的貢獻(xiàn)。

圖2 TM與還原糖糖基化反應(yīng)的進(jìn)展

糖基化反應(yīng)誘導(dǎo)TM構(gòu)象改變，致敏降低

由于糖基化反應(yīng)修飾了TM的氨基酸殘基，從而改變了一級(jí)結(jié)構(gòu)。通過遠(yuǎn)紫外CD分析了TM和相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)物（圖3A）。結(jié)果表明，TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，而不是β-折疊、β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)則卷曲，覆蓋了整個(gè)蛋白質(zhì)的83.44%左右。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，GA-TM和DGA-TM的α-螺旋含量下降了35%以上。相反，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量隨著反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸增加。這些結(jié)果表明，糖基化反應(yīng)通過誘導(dǎo)從α-螺旋到β-折疊的交替來改變TM構(gòu)象。紫外吸收光譜TM構(gòu)象的結(jié)構(gòu)變化反映在紫外吸收的變化上。如圖3B所示，DGA-TM和GA-TM樣品中的吸光度峰出現(xiàn)了2.0和4.0 nm的紅移。此外，TM在不同條件下糖基化時(shí)，吸光度峰在波長上的偏移、紫外吸收峰也存在差異。如圖3C所示，與TM相比，糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度顯著下降，從TM的710.3下降到DGA-TM的503.5和GA-TM的404.8，表明蛋白質(zhì)極性發(fā)生變化，芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移到更親水的環(huán)境中。通過ELISA與過敏患者血清測定了TM和相關(guān)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的過敏性。如圖3D所示，GA-TM和DGA-TM可以消除TM的大部分致敏性（＞40%）。這些結(jié)果證明了糖基化反應(yīng)在消除TM過敏性方面的有效性，這可以作為未來過敏性食品加工的潛在方法。

圖3 糖基化對TM結(jié)構(gòu)變化和體外致敏的影響

糖基化修飾緩解TM引起的食物過敏

糖基化修飾可緩解過敏癥狀

蝦過敏小鼠模型表現(xiàn)出典型的過敏反應(yīng)。臨床過敏反應(yīng)癥狀是反映過敏程度的直觀指標(biāo)，包括過敏和腹瀉評(píng)分、體質(zhì)量變化以及直腸和體表溫度。與對照小鼠相比，所有TM致敏小鼠都表現(xiàn)出反應(yīng)。食物過敏會(huì)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量緩慢增加和體溫異常下降，這與血管舒張引起的供血溫度降低有關(guān)。從無花果中可以看出。S4A-E，過敏導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增加減少、恐懼和腹瀉、直腸和體表溫度降低以及過敏癥狀。相比之下，GA-TM和DGA-TM的治療，小鼠過敏癥狀可得到緩解（P＜0.05）。

小鼠血清中IgE、HIS和細(xì)胞因子的評(píng)估

小鼠模型開發(fā)中普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)是誘導(dǎo)對過敏成分的特定IgE反應(yīng)并通過優(yōu)化的ELISA技術(shù)進(jìn)行定量。如圖4A-C所示，與對照組相比，TM組的IgE和IgG1水平顯著升高（P＜0.05），IgG2a水平相反（P＜0.05）。GA-TM和DGA-TM處理后，IgE水平分別降低32.82%和52.53%。血清中的組胺水平可能因過敏原的致敏而異。與TM相比，GA-TM和DGA-TM顯著降低了圖4D中的組胺釋放（P<0.05）。Th1/Th2免疫失衡是過敏的誘因之一。探討糖基化對Th1/Th2平衡的影響，檢測到代表性細(xì)胞因子IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）。如圖4E和F所示，TM顯著降低了IFN-γ的含量（P＜0.05），并顯著提高了IL-4的水平（P＜0.05），這表明T細(xì)胞傾向于Th2極化，引起過敏反應(yīng)。盡管如此，糖基化的處理減輕了TM誘導(dǎo)的Th1/Th2失衡。通過與葡聚糖糖化聯(lián)合緩解牛奶蛋白過敏患者。IFN-γ和IL-4的比值常被用作確定Th1/Th2細(xì)胞分化狀態(tài)的指標(biāo)。如圖4G所示，TM組Th1/Th2水平下降了74.43%，而GA-TM和DGA-TM促進(jìn)了Th1/Th2的表達(dá)（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，TM可能會(huì)破壞過敏小鼠的Th1/Th2平衡。糖基化可能通過下調(diào)Th2相關(guān)細(xì)胞因子和上調(diào)Th1細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而抑制TM過敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致食物過敏癥狀加重。

圖4 糖基化對小鼠（A）IgE、（B）IgG1、（C）IgG2a、（D）HIS、（E）IFN-γ、（F）IL-4和（G）Th1/Th2釋放的影響

糖基化減輕空腸損傷

食物過敏會(huì)破壞腸道屏障，容易使過敏原侵入人體，加重過敏。在TM模型中通過HE染色觀察到小鼠腸道屏障的變化（圖5A）。與對照組相比，TM、小鼠存在明顯的腸道損傷。然而，GA-TM組小鼠腸道損傷較少，DGA-TM組表現(xiàn)出正常的組織學(xué)特征，并表現(xiàn)出完整的絨毛結(jié)構(gòu)。在腸上皮細(xì)胞中，杯狀細(xì)胞增強(qiáng)了腸道穩(wěn)態(tài)和耐受性。因此，在TM模型中檢查了小鼠空腸杯狀細(xì)胞的含量。如圖5B所示，GA-TM和DGA-TM組的杯狀細(xì)胞水平與TM組相比顯著降低（P＜0.05）。活化的肥大細(xì)胞釋放了無數(shù)炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致通常與過敏反應(yīng)相關(guān)的臨床癥狀的發(fā)展。如圖5C所示，肥大細(xì)胞聚集，細(xì)胞膜破壞和邊界不規(guī)則且擴(kuò)散，而在GA和DGA治療后，肥大細(xì)胞數(shù)量較TM減少（P＜0.05）。結(jié)果表明，糖基化修飾不僅能緩解TM誘導(dǎo)的過敏癥狀，還能減少過敏癥狀引起的腸道損傷。

圖5 小鼠空腸切片的觀察

糖基化修飾調(diào)節(jié)過敏因子

為更好地理解糖基化修飾對TM潛在致敏性的影響，本研究通過qPCR檢測了小鼠脾臟中Th1偏向性、Th2偏向性、Treg偏向性及Th17偏向性細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TM組和DH-TM組中Th1偏向性細(xì)胞因子（IFN-γ）和轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）的表達(dá)水平顯著降低（圖6A）。對于Th2偏向性細(xì)胞因子IL-4和轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的mRNA表達(dá)水平，所有實(shí)驗(yàn)組均較對照組顯著升高（圖6B）。此外，為探究Th17/Treg應(yīng)答平衡的變化，本研究檢測了TGF-β、IL-17以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXp3和RORγt的表達(dá)情況。GA-TM組和DGA-TM組中TGF-β和FOXp3的表達(dá)水平均高于TM組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6C）。相反，GA-TM組和DGA-TM組小鼠體內(nèi)IL-17和RORγt的表達(dá)水平顯著低于TM組（圖6D）。上述結(jié)果表明，糖基化修飾的TM處理可通過改善小鼠體內(nèi)Th17與Treg細(xì)胞的失衡狀態(tài)降低其致敏性。各組關(guān)鍵緊密連接（TJ）蛋白的表達(dá)及定位結(jié)果顯示，這些蛋白不僅受致敏作用調(diào)控，還受上皮細(xì)胞中微生物群組成的影響。TM激發(fā)后，TJ蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）（圖6E），其中TM組上述蛋白水平分別較對照組降低58%、52%和55%。DGA-TM組的ZO-1、Occludin和Claudin-1水平顯著升高（P＜0.05），而GA-TM組無顯著升高。上述結(jié)果表明，DGA-TM可通過上調(diào)TJ蛋白表達(dá)維持腸道屏障完整性，保護(hù)腸上皮屏障免受損傷。

圖6 糖基化TM對細(xì)胞因子和空腸TJ表達(dá)的影響

Conclusion

綜上所述，通過LC-MS/MS鑒定純化的TM為Lit v 1，潛在表位分布在肽鏈上。GA和DGA的糖基化改變了TM的構(gòu)象，暴露了芳香族氨基酸殘基，并顯著降低了體外IgE結(jié)合能力。GA-TM和DGA-TM不足以刺激BALB/c小鼠過敏，TM的糖基化修飾改善了IgE、IgG1、HIS、IL-4和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、IL-17和RORγt的分泌，促進(jìn)了細(xì)胞因子IFN-γ、T-bet、TGF-β和Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)了Th1/Th2和Treg/Th17之間的平衡。此外，糖基化修飾的TM增加了腸道TJ蛋白的表達(dá)，降低了TM致敏。總體而言，具有過敏潛力的純化蛋白質(zhì)可能會(huì)引起敏感個(gè)體的嚴(yán)重過敏反應(yīng)，這些致敏蛋白的糖基化可能是對抗蝦過敏的有效方法。

Pectin oligosaccharides glycosylation modification reduced the sensitization of shrimp tropomyosin by regulating cytokines expression and Th1/Th2 immune balance

Mengya Zhaoa,1, Chunyu Wua,1, Jing Liub, Xinian Lia, Zhenpeng Gaoa, Xin Yangc, Di Liua, Fangyu Longa,*

a College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

b Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550005, China

c College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Tropomyosin (TM) is the predominant allergenic protein in shrimp, which has induced IgE-mediated food allergy reactions. In this study, Lit v 1 was purified from Penaeus vannamei muscles, which were glycosylated by pectic oligosaccharides. The results showed that di-galacturonic acid (DGA) and galacturonic acid (GA) induced the unfolding of the primary protein structure of TM, and changed α-helical structure, and IgE binding capacity. In addition, compared with TM-sensitized BALB/c mice, GA-modified TM (GA-TM) and DGA-modified TM (DGA-TM) were insufficient to stimulate sensitization, and significantly reduced the hypersecretion of IgE, IgG1, HIS, and IL-4, up-regulated IgG2a and IFN-γ levels to improve imbalanced Th1/Th2, Treg/Th17 immunity, and promoted mRNA expression of tight junction proteins. Together, this study confirmed that glycosylation modification alleviated sensitization by altering TM structure, reducing IgE binding allergic inflammatory response, and regulating cytokine immune balance. Overall, these results indicated that glycosylation modification was a promising method for decreasing the allergenic reactivity of allergic proteins.

Reference:

ZHAO M Y, WU C Y, LIU J, et al. Pectin oligosaccharides glycosylation modification reduced the sensitization of shrimp tropomyosin by regulating cytokines expression and Th1/Th2 immune balance[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250301. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250301.

翻譯： 田雨欣（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網(wǎng)

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