打破認知差：培養基干凈 ≠ 內毒素安全，0.02 ng/mL 就能激活免疫反應

內毒素是一種由細菌細胞壁分解產生的毒性物質,其主要成分為脂多糖（LPS），是細胞培養過程中不容忽視的問題。細胞培養試劑或介質內毒素過高，會干擾細胞的正常生長和分化，甚至導致實驗失敗。內毒素通過誘導炎癥反應抑制細胞生長或誘導其凋亡。研究發現，低濃度內毒素（< 1 ng/mL，1 ng ≈ 10 EU）可刺激細胞產生細胞因子、激活小鼠巨噬細胞。

內毒素如何偷偷毀掉細胞實驗？

細胞莫名其妙死亡、轉染效率低至 30%、同樣的 protocol 卻做不出重復結果——遇到這些問題，你的第一反應是什么？細胞狀態不好？血清批次有問題？轉染試劑不給力？

很少有人會想到這可能是內毒素在「搗亂」。它隱藏在細胞培養基、添加物、質粒中，難以被發現，卻悄無聲息地吞噬著實驗數據和結果。內毒素可能從一開始就在那里，只是你從來沒測過。

你以為培養基澄清透明就是干凈的？你以為「內毒素達標」就安全了？藥典標準是 0.5 EU/mL，但你的細胞實驗需要的，可能是比藥典嚴苛 10 倍的條件。內毒素是細胞培養中最容易被忽視的「潛伏者」。它藏在血清里、藏在重組蛋白里、藏在質粒里，悄無聲息地篡改你的實驗數據。這一次，我們來聊聊這個你「以為知道」、但可能低估了的隱形殺手。

一、0.02 ng/mL 的內毒素就能對細胞培養產生影響

多種細胞易受內毒素影響，如巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、肝細胞、血小板、內皮細胞等。極低濃度的內毒素就能干擾細胞正常的生理功能。Schwarz H 等人發現 0.02～2 ng/m L的脂多糖（LPS）能激活細胞的免疫反應，且不同細胞對內毒素的敏感度不一樣。如 THP-1 細胞在受到最高濃度 LPS（2 ng/mL）刺激時，僅 IL-8 表達量顯著增加，而在相同濃度下，moDCs 會大量分泌 IL-6、IL-8、IL-12 和 TNF-α。人單核細胞和 CD1c+ DCs 對內毒素更敏感，0.2 ng/mL 的 LPS 能夠誘導所有細胞因子釋放。

0.02 ng/mL 是什么概念？相當于在標準游泳池里滴入一滴水，濃度低到可以忽略不計。但對于 THP-1 細胞、樹突狀細胞、原代免疫細胞來說，這個濃度的內毒素足以讓它們「炸鍋」，細胞還沒開始正式實驗，就已經被「提前激活」了。

低濃度 LPS 對不同人類免疫細胞細胞因子產生的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內毒素能夠與細胞膜上的受體結合，激活免疫反應，釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子，影響細胞生理功能和信號通路紊亂，進而影響細胞生長和代謝，甚至造成細胞凋亡。內毒素提前激活免疫細胞會干擾對細胞因子正常免疫調節功能的研究，出現實驗結果偏差。

內毒素過高會造成細胞形態發生明顯變化，如體積縮小、折光率降低等。內毒素還抑制細胞的增殖，如 G0/G1 期延長、S 期縮短等會導致細胞生長停滯或凋亡。內毒素在敏感細胞中誘導 caspase-3 介導的凋亡通路，使原代細胞存活率驟降。內毒素通過磷酸基團與細胞膜上的蛋白質發生反應，或脂肪酸鏈與細胞膜上的脂質膜和蛋白質親水區發生作用，改變細胞膜形態，導致細胞功能障礙。

研究人員通過 MTT 法測定了脂多糖（LPS）對 H292 和 THP-1 細胞的毒性作用。結果發現，與未處理的對照組相比，低濃度（1～2.5 μg/mL） LPS 處理后，細胞活力未觀察到顯著變化，表明此濃度下的 LPS 對細胞無毒性。而高濃度（5～20 μg/mL）的 LPS 對 H292 和 THP-1 細胞具有顯著的細胞毒性。

LPS 刺激對 H292 與 THP-1 細胞活力的影響（源自文獻：DOI：10.3892/mmr.2018.8542）

內毒素對細胞功能有顯著影響，如影響細胞的基因表達、能量代謝和蛋白質合成。內毒素還會與轉染試劑、質粒 DNA 降低細胞轉染效率。

因此，在細胞培養實驗中，內毒素影響細胞的生理狀態和功能，降低實驗的可靠性和可重復性，此外，內毒素的存在可能影響細胞因子和蛋白質的表達控制，細胞信號通路、蛋白質相互作用等研究需要注意內毒素的干擾。對于細胞衍生產品（如疫苗、免疫細胞治療等）更應關注內毒素污染。

二. 細胞培養過程中如何避免內毒素污染

革蘭氏陰性菌是細胞培養環境中的常見污染源，細菌死亡裂解或導致內毒素釋放。培養基中的血清或蛋白質成分含有較高內毒素也會影響細胞生長。在細胞的傳代、凍存等環節操作不當也會導致內毒素污染。細胞培養所有容器和包裝材料也會因制造工藝而含有內毒素。

針對內毒素污染的來源，可以通過以下措施控制內毒素：

原料控制：選擇低內毒素或超低內毒素的試劑和介質，從源頭控制內毒素。

細胞株選擇：某些腫瘤細胞株對內毒素敏感度較低可優先選擇。

培養環境選擇：定期殺菌和在位清洗，減少大腸桿菌污染。優化細胞培養條件，如溫度、pH 值、滲透壓等，以降低內毒素對細胞的不良影響。

質量控制：對所用試劑進行內毒素檢測，保證內毒素含量符合標準。

人員培訓：確保操作合規，避免人員操作問題引入細菌內毒素。

三、重組蛋白內毒素對細胞培養的影響

重組細胞因子在細胞培養和擴增分化過程中具有重要作用。免疫學實驗、細胞凋亡實驗、干細胞培養與分化、類器官模型構建等，都需要使用低水平內毒素的細胞因子。細胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平內毒素的重組蛋白是獲取可靠實驗結果的基礎。

為評估重組蛋白中內毒素對細胞的免疫反應，Schwarz H 等人構建了對 LPS 高度敏感的 HEK293 細胞，將這些細胞分別暴露于不同濃度的重組蛋白（來自兩個不同的供應商）和 LPS 中。結果顯示，供應商 1 的重組蛋白可使 NF-kB 表達量升高，而供應商 2 的重組蛋白則未激活 NF-kB 表達。供應商 1 重組蛋白誘導 NF-kB 表達的效果與 0.02 ng/mL LPS 相近，說明重組蛋白中少量內毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng 蛋白）足以激活 NF-κB 通路。

內毒素對 HEK293 細胞中 NF-kB 激活的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內毒素污染自查清單

你中了幾條？

以下場景，如果你中了 3 條以上，你的實驗數據可能正在被內毒素「偷走」。

試劑耗材篇

用的重組蛋白、細胞因子，從來沒測過內毒素水平

只知道內毒素「達標」（< 0.5 EU/mL），不知道自己的細胞需要多低的閾值

血清分裝后反復凍融，瓶口有肉眼可見的殘留

用的超純水，超過一周沒換機、沒測電阻率

日常操作篇

培養基配制后，存放超過兩周還在用

槍頭、離心管是「國產某品牌」，但沒驗證過無熱原

開瓶后的試劑，瓶蓋朝下放在臺面上

細胞房里的酒精棉球，泡了三天沒換

培養環境篇

培養箱水盤里的水，一個月沒換過

細胞房最近有過細菌污染，簡單消殺后繼續用

同一瓶培養基，同時養免疫細胞和腫瘤細胞

做原代細胞培養，沒單獨配一瓶「專用培養基」

細胞狀態篇

細胞長得慢，第一反應是「血清不行」，而不是測一下內毒素

轉染效率突然下降，懷疑是質粒問題，沒想過是內毒素干擾

同樣 protocol，兩個人做出來結果不一樣，以為是操作問題

細胞形態沒變、培養基也沒渾，就默認「沒問題」

如果你中了 3 條以上，建議下次實驗前，先測一下你的培養基、血清、重組蛋白——內毒素這個「隱形殺手」，可能比你想象的離你更近。自查清單里那些「坑」，有些靠規范操作就能填上——比如勤換水、不反復凍融、分區使用培養基。但有些問題，不是操作能解決的：你用的重組蛋白本身自帶內毒素，換再多槍頭、擦再多遍臺面也沒用。這時候就需要從源頭入手——選擇真正「超低內毒素」的試劑，而不是只看標簽上寫著「達標」。

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內容策劃：王丹琦

內容審核：周育紅

題圖來源：圖蟲創意

參考文獻：

[1] Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

[2] Xuefang Liu, et al. LPS?induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542