Advanced science | 安徽醫(yī)科大學(xué)徐濤教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子

肝纖維化是慢性肝病向肝硬化、肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵病理階段，全球約有3.3%的人群存在晚期肝纖維化。然而，臨床上至今尚無獲批的抗肝纖維化藥物，其背后的分子機(jī)制和有效干預(yù)靶點(diǎn)一直是該領(lǐng)域亟待突破的核心難題。近年來，靶向肝星狀細(xì)胞（HSCs）被認(rèn)為是治療肝纖維化最有前景的方向之一。但核孔蛋白NUP85在這一過程中究竟扮演什么角色？此前從未被系統(tǒng)研究過。

2026年3月29日，安徽醫(yī)科大學(xué)徐濤教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中科大第一附屬醫(yī)院陳昭琳教授在Advanced science雜志在線發(fā)表題為NUP85 Mediates Endoplasmic Reticulum Stress through the USP47/ASK1 Signaling Pathway to Regulate the Progression of Liver Fibrosis的研究論文首次揭示：NUP85是肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。此外，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了靶向活化HSCs的CREKA肽修飾脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，將NUP85小分子抑制劑Mogroside V精準(zhǔn)遞送至活化的HSCs，實(shí)現(xiàn)了安全、高效的治療效果。

首先，為評估NUP85與肝纖維化進(jìn)展的相關(guān)性，分析了多個(gè)GEO數(shù)據(jù)集（GSE55747、GSE25097、GSE84044、GSE15654）。結(jié)果顯示，在CCl?誘導(dǎo)的肝纖維化、肝硬化及晚期纖維化（S2-4）患者中，NUP85表達(dá)均顯著上調(diào)，且肝癌肝硬化患者高于非肝癌肝硬化患者；NUP85表達(dá)與ACTA2、Col1A1、Col3A1等纖維化標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)（r=0.581、0.300、0.413）（圖1A-G）。進(jìn)一步在臨床肝纖維化患者及小鼠模型中進(jìn)行驗(yàn)證，H&E、Masson、天狼猩紅染色證實(shí)了典型的纖維化病理改變，免疫熒光、免疫組化、Western blotting及RT-qPCR均顯示NUP85表達(dá)顯著升高（圖1H-L，圖S1A-G）。在TGF-β1激活的LX-2細(xì)胞中，NUP85表達(dá)同樣上調(diào)（圖S1H-K）。原代細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)表明，NUP85主要在活化的HSCs中選擇性上調(diào)，而在肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞中變化不顯著，該現(xiàn)象在CCl?及BDL兩種模型中均得到驗(yàn)證（圖S2）。以上結(jié)果為NUP85表達(dá)水平與肝纖維化進(jìn)展之間的顯著相關(guān)性提供了充分證據(jù)。

接下來，為探究NUP85在肝纖維化中的作用，分別構(gòu)建了肝特異性（AAV8介導(dǎo)）和HSCs特異性（AAV2-Lrat介導(dǎo)）NUP85敲低小鼠模型。在CCl?及BDL兩種肝纖維化模型中，肝特異性敲低NUP85可顯著降低血清ALT、AST、ALP水平，減少羥脯氨酸含量，減輕Masson及天狼猩紅染色顯示的膠原沉積面積，并下調(diào)纖維化標(biāo)志物α-SMA、Col1A1、Col3A1的mRNA及蛋白表達(dá)（圖S3-S5）。HSCs特異性敲低NUP85同樣改善了上述肝損傷及纖維化指標(biāo)（圖2，圖S4，圖S6）。為進(jìn)一步驗(yàn)證NUP85的促纖維化功能，在NUP85敲除小鼠中通過AAV2-Lrat-oeNUP85恢復(fù)（過表達(dá)）NUP85，結(jié)果顯示ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量升高，膠原沉積面積擴(kuò)大，α-SMA、Col1A1、Col3A1表達(dá)上調(diào)，纖維化程度顯著加?。?b>圖S7-S8）。以上結(jié)果表明，NUP85在肝纖維化中發(fā)揮促纖維化作用，且該作用主要依賴于HSCs中的NUP85。

為探究NUP85在HSCs活化中的作用，首先確定TGF-β1的最佳刺激條件（10 ng/mL處理24小時(shí)），此條件下NUP85蛋白表達(dá)達(dá)峰值（圖S9A-D）。隨后驗(yàn)證了NUP85-siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，確認(rèn)其可有效敲低或上調(diào)NUP85表達(dá)（圖S9E-L）。功能實(shí)驗(yàn)表明，在TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中，敲低NUP85可顯著降低纖維化標(biāo)志物α-SMA、Col1A1和Col3A1的mRNA及蛋白水平，而過表達(dá)NUP85則上調(diào)這些標(biāo)志物（圖3A-L）。在原代小鼠HSC中，NUP85敲低同樣抑制了細(xì)胞自發(fā)活化，表現(xiàn)為上述標(biāo)志物表達(dá)降低（圖S10）。以上結(jié)果表明，敲低NUP85可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSCs活化。

為闡明NUP85調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制，對正常和NUP85敲低小鼠肝組織進(jìn)行RNA-seq，GO富集分析顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）通路顯著受影響（圖4A-B）。體內(nèi)外驗(yàn)證表明，在CCl?誘導(dǎo)的小鼠及TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中，敲低NUP85可顯著降低ERS標(biāo)志物（GRP78、ATF4、p-IRE1、CHOP）的表達(dá)，而過表達(dá)NUP85則升高這些標(biāo)志物水平（圖4C-F，圖S11A-G）。為進(jìn)一步驗(yàn)證ERS在NUP85調(diào)控肝纖維化中的關(guān)鍵作用，使用ERS激活劑衣霉素（TM）進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，TM處理可部分逆轉(zhuǎn)NUP85敲低對ERS、肝損傷及膠原沉積的抑制作用，表現(xiàn)為ERS標(biāo)志物及纖維化標(biāo)志物（α-SMA、Col1A1、Col3A1）表達(dá)回升，血清ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量增加，Masson和天狼猩紅陽性面積擴(kuò)大（圖4G-P，圖S11H-Q）。以上結(jié)果表明，ERS是NUP85調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵介導(dǎo)因素。

為進(jìn)一步闡明NUP85在肝纖維化中的作用，對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，對照組與NUP85敲低組小鼠的基因表達(dá)模式存在顯著差異，其中MAPK信號通路是最顯著改變的通路（圖5A-B）。體內(nèi)外驗(yàn)證表明，在CCl?誘導(dǎo)的小鼠及TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中，NUP85敲低可抑制ASK1、JNK、p38的磷酸化激活，而NUP85過表達(dá)則增強(qiáng)其磷酸化水平（圖5C-D，圖S12）。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)的ASK1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)NUP85敲低對HSC活化的抑制效應(yīng)；而ASK1特異性抑制劑GS-4997則可消除NUP85過表達(dá)驅(qū)動(dòng)的促活化效應(yīng)（圖5E-L，圖S13I-L）。此外，NUP85對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控同樣依賴于ASK1信號通路。以上結(jié)果表明，ASK1是NUP85調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)。

為闡明NUP85調(diào)控ASK1活性的機(jī)制，檢測了ASK1的泛素化和磷酸化水平。結(jié)果顯示，肝纖維化中ASK1的泛素化及磷酸化水平均升高，且NUP85可正向調(diào)控二者水平（圖S14A-C）。使用泛素化抑制劑TAK-243可阻斷NUP85對ASK1的調(diào)控作用，而廣譜激酶抑制劑無此效應(yīng)，提示NUP85通過泛素修飾影響ASK1磷酸化活性（圖S14D-F）。通過IP-MS聯(lián)合RNA-seq篩選，結(jié)合免疫共沉淀和免疫熒光驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)NUP85與去泛素化酶USP47存在直接相互作用，且NUP85可正向調(diào)控USP47的表達(dá)水平（圖6A-D，圖S15）。在TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中進(jìn)行NUP85與USP47的共敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示同時(shí)敲低USP47可部分逆轉(zhuǎn)NUP85敲低對纖維化標(biāo)志物（α-SMA、Col1A1、Col3A1）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物（GRP78、ATF4、CHOP等）的抑制作用（圖6E-H，圖S16）。以上結(jié)果表明，NUP85通過與USP47結(jié)合，調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。

為探究NUP85通過USP47調(diào)控ASK1泛素化的機(jī)制，首先驗(yàn)證了USP47與ASK1的相互作用。免疫熒光和免疫共沉淀顯示，二者在LX-2細(xì)胞中共定位且直接結(jié)合（圖7A-C）。USP47過表達(dá)未影響ASK1的K48泛素化，但顯著抑制其K63泛素化（圖7D-E）。競爭性實(shí)驗(yàn)表明，NUP85與ASK1競爭結(jié)合USP47的C19C結(jié)構(gòu)域（圖7F-J，圖S14I-J）。通過LC-MS/MS鑒定出ASK1上四個(gè)潛在泛素化位點(diǎn)（K454、K458、K805、K1081），進(jìn)一步構(gòu)建點(diǎn)突變體進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)K805R突變可阻斷NUP85和USP47對ASK1泛素化水平的調(diào)控，而其他位點(diǎn)突變無此效應(yīng)（圖7K-N）。經(jīng)質(zhì)譜獨(dú)立驗(yàn)證，K805為ASK1的關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)（圖7O）。以上結(jié)果表明，NUP85通過USP47介導(dǎo)ASK1第805位賴氨酸的去泛素化修飾。

為進(jìn)一步探究NUP85的治療潛力，通過虛擬篩選和分子對接發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物羅漢果苷V（MV）可靶向NUP85，CETSA驗(yàn)證了其結(jié)合能力（圖S17A-D）。10~80 μM的MV對LX-2細(xì)胞無毒性，且呈劑量依賴性抑制α-SMA和Col1A1表達(dá)（圖S17E-G）。在CCl?誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中，MV灌胃處理可降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平、減輕膠原沉積、下調(diào)纖維化標(biāo)志物及ERS標(biāo)志物（圖S18）。為提高靶向性，構(gòu)建了CREKA肽修飾的PEG化脂質(zhì)體包載MV（CREKA-Lip/MV），粒徑約110 nm，球形均一，可持續(xù)釋放（圖8A-D）。體內(nèi)成像顯示CREKA修飾顯著增強(qiáng)脂質(zhì)體在纖維化肝臟中的富集（圖8E）。與游離MV相比，CREKA-Lip/MV更能有效降低血清ALT、AST、ALP及羥脯氨酸含量，減少膠原沉積，下調(diào)NUP85及纖維化標(biāo)志物表達(dá)（圖8F-L，圖S19A-B）。體外實(shí)驗(yàn)同樣顯示CREKA-Lip/MV較游離MV更顯著抑制LX-2細(xì)胞活化（圖S19C-G）。CCK-8及主要器官H&E染色證實(shí)其生物安全性良好（圖S20）。以上結(jié)果表明，CREKA-Lip/MV通過靶向HSCs中的NUP85安全有效地緩解肝纖維化。

本研究揭示了NUP85是肝纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。NUP85在纖維化肝組織中顯著上調(diào)，尤其在活化的HSCs中。敲低NUP85可減輕CCl?和BDL誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，過表達(dá)則加劇。機(jī)制上，NUP85競爭性結(jié)合去泛素化酶USP47，阻斷其對ASK1的K63去泛素化，增強(qiáng)ASK1磷酸化及下游JNK/p38信號，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)HSCs活化。靶向NUP85的天然產(chǎn)物羅漢果苷V（MV）可抑制纖維化，而CREKA肽修飾的脂質(zhì)體遞送MV（CREKA-Lip/MV）能靶向活化的HSCs，安全高效地緩解肝纖維化。NUP85-USP47-ASK1軸是肝纖維化治療的潛在新方向。

徐濤教授課題組長期致力于研究肝臟疾病中的分子機(jī)制與藥物干預(yù)，尤其是在肝臟炎癌轉(zhuǎn)化方面。課題組前期研究成果NUP85在MASH發(fā)病中的關(guān)鍵作用及分子機(jī)制已發(fā)表于Int. J. Biol. Sci. doi: 10.7150/ijbs.92337.徐濤教授，博導(dǎo)，博士后合作導(dǎo)師，銅陵市衛(wèi)生健康委黨組成員副主任（掛職），入選2025年全球前2%頂尖科學(xué)家榜單（World's Top 2% Scientists），2025年安徽省青年基金A類項(xiàng)目（原省杰青），2024年安徽省高校杰青項(xiàng)目，安徽省教育廳優(yōu)秀青年教師培育項(xiàng)目（重點(diǎn)類）、安徽醫(yī)科大學(xué)青年雙培工程人才。2019年獲得安徽省自然科學(xué)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)，安徽省教學(xué)成果一等獎(jiǎng)。2020年獲得首屆安徽醫(yī)科大學(xué)復(fù)元科技新星。主持國家自然科學(xué)基金，安徽省自然科學(xué)基金，安徽省經(jīng)濟(jì)發(fā)展重大課題，安徽省衛(wèi)健委軟科學(xué)研究項(xiàng)目等18項(xiàng)科研項(xiàng)目。發(fā)表論文160篇，其中SCI第一作者/通訊作者80余篇，多篇刊登于中科院1區(qū)TOP期刊。兼任eGastroenterology 編委，《Oncologie》編委, World Journal of Integrated traditional and western Medicine（WJIM)青年編委，Medicine Advances青年編委，《中國藥理學(xué)通報(bào)》雜志青年編委,《現(xiàn)代藥物與臨床》雜志青年編委。課題組因發(fā)展需要，長期招聘博士及博士后科研人員，熱忱歡迎具有肝臟和生物學(xué)相關(guān)背景，有志于機(jī)制探索與藥物研究的青年才俊加入，也歡迎本科生和碩士生報(bào)考本課題組的研究生。

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