Adv Sci：基于結構色納米腔的智能無染色組織學分析

論文信息：

Q. Chen, Y. Ren, L. Hu, Y. Li, W. Liang, J. Wang, H. Gao, X. Wang, J. Li, Q. He, Y. Zhu, H. Hu, Q. Zhan, I. Gallouzi, J. Merzaban, D. Wang, Z. Du, X. Gu, Q. Gan, Intelligent Stain‐Free Histology on Structural Colorimetric Nanocavities, Advanced Science (2026) e14340.

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202514340.

研究背景

現代病理診斷離不開顯微鏡下對組織形態和顏色分布的判斷，但臨床金標準的蘇木精-伊紅染色不僅耗時費力、成本高，還會因為染液濃度波動和試劑質量差異帶來一致性問題，而且診斷質量在很大程度上依賴病理醫生的經驗與主觀判斷，這在數字化與個體化醫療越來越強調標準化、可復制的背景下就成了瓶頸，于是人們開始探索免染色的組織學成像來降低化學染色的成本與勞動強度，不過已有方案要么依賴昂貴復雜的中紅外或其他先進顯微系統，要么像“虛擬染色”那樣需要大量高質量訓練數據和高端成像設備，最近出現的等離激元納米孔陣列載玻片雖然能用常見明場顯微鏡在無標記切片上做出可用于判別的顏色對比，但其金屬薄膜納米圖案的制備依舊昂貴復雜，難以規模化進入醫院常規流程，因此迫切需要一種更便宜、更易制造、又能直接融入現有臨床硬件并適合AI大規模數據采集的免染色組織學成像平臺 。本文 開發了干涉納米腔平面結構，只需簡單的鍍膜便可實現各種顏色。將病理切片貼上去之后，免去了傳統染色步驟，可直接看到對比度清晰的細胞圖，大幅度減少制樣時間和花費。和人工智能結合，可以做到快速準確診斷。

研究內容

病理診斷里最常見的套路還是看 H&E 染色切片，但這個流程既費時費力，又容易受試劑濃度、染色液質量和操作一致性影響，結果還高度依賴病理醫生經驗，所以在追求標準化、數字化和更低成本的臨床環境里就顯得有點“老派又昂貴”了。過去十年出現過不少免染色思路，比如中紅外光譜化學成像、虛擬染色等，但往往需要更復雜昂貴的成像設備或海量訓練數據；即便是納米光子芯片這種能在普通明場顯微鏡下做顏色對比的方案，也常被高成本的納米加工卡住了。作者因此把目標定得很直接，用更便宜、更容易量產的平面納米腔結構來做免染色組織學成像，并把后續 AI 輔助篩查也一并納入同一條工作流里。

圖 1 基于硅基結構色比色納米腔（NOS）載玻片的先進無染色組織學分析。

(a) 智能組織學診斷示意圖，插圖為分層 NOS 載玻片結構設計。

(b) 12 片 6 英寸 NOS 晶圓的光學照片，插圖展示干涉的光學機理。

(c) 對應的反射光譜。右上角標注了 Si?N? 層厚度（單位：nm）；下方部分給出了未覆蓋 Si?N? 層的硅晶圓反射情況。

(d、e) 玻璃載玻片上連續切取、名義厚度為 2 μm 的人結直腸上皮組織切片的對比顯微圖像： (d) 未進行 H&E 染色；(e) 進行了 H&E 染色。

(f–k) 不同顏色的 NOS 載玻片，其中頂層 Si?N? 厚度分別為： (f) 268 nm，(g) 243 nm，(h) 197 nm，(i) 158 nm，(j) 111 nm，(k) 85 nm。

所有圖像均使用 10× 物鏡（NA = 0.3）采集。圖 d–k 的比例尺：50 μm。

圖1主要在講“底座”到底是什么，以及它為什么能讓組織在不染色的情況下出現可讀的顏色對比。NOS 玻片本質上就是在硅片上沉積一層納米級厚度的氮化硅，通過反射光的薄膜干涉產生結構色，調一調氮化硅厚度就能得到一系列不同的底色與反射譜共振位置。然后作者把同一來源的結直腸上皮連續切片分別放在普通玻片和不同顏色的 NOS 玻片上做對比，能直觀看到 NOS 提供的顏色層次明顯更豐富，組織形態細節也更容易被“顏色差”帶出來，為后面定量分析和診斷鋪路。

圖 2 硅基結構色比色納米腔（NOS）載玻片的分析。

(a) 健康與癌變結腸組織的折射率（RI）分布圖灰度圖像；灰度值與 RI 對應。比例尺：10 μm。

(b) (a) 中組織 RI 值的統計分布。

(c) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 0.5 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(d) 在 CIE 色度圖上模擬得到：厚度 1 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在綠色 NOS 載玻片上的顏色位置變化。

(e) 人結直腸上皮組織切片的顯微圖像，標出用于計算與分析的健康區域（藍框）和癌變區域（紅框）。玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲取；兩幅 NOS 圖像則使用 4× 物鏡（NA = 0.13）拍攝。比例尺：200 μm。

(f) (e) 中綠色 NOS 載玻片對應區域的微區多光譜結果。

(g) 健康區域（藍色，上面板）與癌變區域（紅色，下面板）的 CIELAB 空間分布。

(h) 健康/癌變點云之間云點交并比（IoU）的小提琴圖（中間虛線表示中位數，上/下虛線表示四分位距 IQR；每組 n = 25）。采用雙側獨立樣本 t 檢驗，玻璃 vs. NOS 的 p 值為 1.94×10?1?，H&E vs. NOS 的 p 值為 5.80×10?1?，二者在 α = 0.0001 水平上均具有顯著性。

圖2把“為什么會變色”這件事拆開來做定量解釋，并證明這種顏色差確實能更好地區分健康與癌變區域。作者先用光學衍射層析測了組織的折射率分布，發現健康與癌變上皮的折射率統計分布峰值有明顯差異；再結合 AFM 測到的真實厚度范圍，用傳輸矩陣法去模擬在不同折射率與厚度下 NOS 顏色在 CIE 色度圖上的漂移，說明很小的折射率或厚度變化就能帶來人眼可感知的顏色差。最后他們把實際圖像做成像素級 CIELAB 點云，用點云重疊度 IoU 來量化健康/癌變的顏色分離程度，結果顯示 NOS 上的點云分離優于未染色玻片和傳統 H&E。

圖 3 H&E 染色與 NOS 載玻片圖像中器官與組織病理連續切片的比較。

(a) 健康結直腸上皮，并給出放大的上皮細胞圖像。

(b) 結直腸腺癌及低分化腫瘤。

(c) 健康/癌浸潤的結直腸固有層。

(d) 健康/癌浸潤的結直腸肌層。

(e) 健康/癌變乳腺（左列）、肺（中列）與甲狀腺組織切片（右列）。

(f) 一例結直腸病例及其診斷結果。

玻璃載玻片上的所有圖像均由配備 20× 物鏡（NA = 0.75）的 Leica Aperio 掃描儀獲取；兩幅 NOS 圖像則使用 10× 物鏡（NA = 0.3）拍攝。圖 a–e 的比例尺：100 μm；圖 f 的比例尺：500 μm。

圖3是在回答“這東西是不是只對某一種組織好用”以及“病理醫生能不能直接拿它做判斷”。他們拿了多器官樣本做連續切片對照，在結直腸上皮、固有層、肌層等不同組織結構里，NOS 圖像能復現 H&E 下關鍵的腺體結構、杯狀細胞缺失、細胞異型性、浸潤邊界等診斷要點，并把這種能力擴展到乳腺、肺和甲狀腺等組織。更關鍵的是還做了盲法對比讀片，在一批結直腸病例里，用 NOS 圖像給出的區域劃分和 H&E 參考結果高度一致，用一致率和 Kappa 系數把“能用”這件事量化到了接近臨床可接受的水平。

圖 4 用于輔助評估的機器學習算法及其結果。

(a) AI 算法訓練流程與輔助評估性能測試流程。

(b) 在測試數據集上測試得到的混淆矩陣。

(c) 模型的受試者工作特征（ROC）曲線，AUC 達到 0.987。

(d) 病理學家基于 H&E 染色圖像對一張結直腸組織切片給出的病理診斷結果。

(e) 在與 (d) 對應的、NOS 載玻片上的連續無染色切片中，DenseNet121 模型給出的判別結果。比例尺：500 μm。

圖4把前面“可讀的結構色”順手接到了 AI 上，展示了一個真正能跑起來的輔助評估流程。作者用 NOS 圖像切塊構建結直腸健康/癌變上皮數據集，按病人級別劃分訓練集和測試集，訓練 DenseNet121 這類 CNN 做二分類，在測試集上給出高準確率以及很高的 AUC，并用混淆矩陣和 ROC 曲線把模型性能說清楚。更貼近臨床的是他們把模型輸出做成整片區域的顏色標注，去和病理醫生在 H&E 上圈出的病灶范圍對齊，結果顯示模型在大尺度區域分割上也能較好復現人工標注，而且推理速度足夠快，適合做批量篩查和預分診。

結論與展望

文章提出一種可量產、低成本的免染色病理成像方案，在硅基底上沉積納米厚度氮化硅形成結構色納米腔(NOS)載玻片，用普通明場顯微鏡即可把無標記組織切片的微小厚度與折射率差異轉化為顯著顏色對比。作者通過光學衍射層析獲得折射率分布、用AFM測厚，并以傳輸矩陣法解釋不同組織在CIE色度空間的漂移，證明NOS能比常規未染色玻片與H&E在顏色點云上更好地區分健康與癌變區域。多器官連續切片對照顯示NOS圖像可呈現腺體結構、杯狀細胞變化與浸潤邊界等關鍵病理特征，盲法讀片一致性接近H&E。進一步構建結直腸數據集訓練CNN實現高AUC分類，并生成整片病灶熱圖，展示了可直接接入數字病理與AI篩查的臨床工作流。