用中藥入血成分鑒定發(fā)了篇2區(qū)：清郁養(yǎng)精方調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸、抑制氧化應(yīng)激與凋亡，改善少弱精子癥~

【寫在前面】：本期推薦的是由江蘇省中醫(yī)院、南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示清郁養(yǎng)精方通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸,抑制大鼠睪丸氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的少弱精子癥。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Qingyu Yangjing formula ameliorates cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia by regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and inhibiting testicular oxidative stress and apoptosis in rats

民族藥理學(xué)相關(guān)性

清郁養(yǎng)精方（QYYJF）是一種傳統(tǒng)中藥（TCM），是治療少弱精子癥（OAS）的經(jīng)典方劑，在補(bǔ)腎填精方面具有顯著的臨床療效。然而，其化學(xué)成分尚不明確，且QYYJF治療OAS的作用機(jī)制仍不清楚。

研究目的

表征QYYJF吸收入血的原型化學(xué)成分，并闡明其對大鼠OAS的治療作用。

方法

為鑒定吸收入血的原型化合物，在給大鼠連續(xù)5天灌胃QYYJF（11.55 g/kg）后采集血清樣本，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）進(jìn)行分析。將40只雄性大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（CP）（40 mg/kg），連續(xù)5天，建立OAS模型，隨后分別給予低、中、高劑量（5.77、11.55和17.32 g/kg/d）的QYYJF治療14天。使用Makler計(jì)數(shù)板評估精子質(zhì)量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸激素、睪丸氧化應(yīng)激標(biāo)志物和炎癥細(xì)胞因子。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織病理學(xué)變化，并使用蛋白質(zhì)印跡法（WB）分析凋亡相關(guān)蛋白（Bcl2、Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9）的表達(dá)水平。

結(jié)果

在血清中共檢測到515個(gè)原型成分，其中25個(gè)經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，主要為黃酮類、三萜皂苷類、苯丙素類和內(nèi)酯類化合物。CP誘導(dǎo)的OAS大鼠睪丸重量、睪丸指數(shù)、精子密度和活力顯著降低，HPG軸激素紊亂，氧化應(yīng)激水平升高，炎癥細(xì)胞因子增加。HE結(jié)果顯示睪丸組織出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加。QYYJF治療可改善這些變化，提高精子質(zhì)量，恢復(fù)激素平衡，減輕氧化應(yīng)激和炎癥，并抑制睪丸細(xì)胞凋亡。

結(jié)論

CP通過破壞HPG軸平衡、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來損傷精子發(fā)生。QYYJF通過恢復(fù)HPG軸功能、減輕氧化應(yīng)激和炎癥、抑制睪丸細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對OAS的治療作用。

圖文摘要

【前言】

男性不育癥因不健康的生活方式和日益增加的生活壓力而成為一個(gè)全球性問題。少弱精子癥的特征是精子數(shù)量顯著減少和活力受損，是男性不育的主要原因。全球范圍內(nèi)，15%的育齡夫婦存在不育問題，其中50%與男性不育有關(guān)。西醫(yī)治療該病主要采用左卡尼汀、維生素E和抗雌激素藥物，但由于療效不一和不良反應(yīng)，其臨床應(yīng)用常受限制。

多種化療藥物，包括環(huán)磷酰胺，被廣泛用于癌癥治療。然而，環(huán)磷酰胺是不育癥的主要原因。它通過氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和性激素失衡等機(jī)制，誘導(dǎo)睪丸組織損傷，破壞精子發(fā)生，并導(dǎo)致少弱精子癥。這凸顯了針對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的生殖毒性尋求有效治療策略的迫切性。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥憑借其在治療生殖疾病方面數(shù)千年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為男性不育癥提供了一種有前景的療法。在中醫(yī)理論中，男性不育根據(jù)特定的病因病機(jī)和辨證論治，使用中藥復(fù)方進(jìn)行分類和治療。包含菟絲子、枸杞子及其他補(bǔ)腎中藥的中藥復(fù)方，傳統(tǒng)上用于補(bǔ)腎填精，這是中醫(yī)體系中治療男性不育的關(guān)鍵原則。既往研究闡明了中藥對精子質(zhì)量的潛在益處。然而，這些中藥復(fù)方針對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的生精功能損傷的具體保護(hù)作用、其入血成分的鑒定以及潛在的蛋白質(zhì)通路仍有待深入探索。

精子發(fā)生受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控。中藥通過影響促性腺激素釋放激素、雌二醇、黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮的釋放來調(diào)節(jié)HPG軸激素。此外，中藥還能增強(qiáng)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能，減輕睪丸炎癥，對抗氧化應(yīng)激，并減少細(xì)胞凋亡。同時(shí)，它們可能改善睪丸微環(huán)境，降低睪丸組織中的氧化應(yīng)激，促進(jìn)精子發(fā)生，提高精子質(zhì)量。闡明中藥 Efficacy 的作用機(jī)制對于理解其整體治療效應(yīng)和作用機(jī)理至關(guān)重要。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜組分的快速分離和高靈敏度鑒定。該技術(shù)對于鑒定給藥后吸收入血的中藥復(fù)方生物活性成分至關(guān)重要。

清郁養(yǎng)精方，原名聚精湯，首載于《徐福松男科綱目》，源于徐福松教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，適用于腎虛型少弱精子癥所致的不育癥。因后期中藥新藥轉(zhuǎn)化及江蘇省藥品監(jiān)督管理局審批的要求，“聚精湯”更名為清郁養(yǎng)精方。作為循證中藥復(fù)方，該方經(jīng)過江蘇省中醫(yī)院多年的臨床經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化。近年來，其在少弱精子癥患者中顯示出顯著的治療效果，體現(xiàn)了中醫(yī)治療少弱精子癥的 holistic 理念。該方基于“腎主生殖”理論，融合“補(bǔ)腎”與“填精”之法，針對少弱精子癥的核心病機(jī)——腎精虧虛進(jìn)行治療。該方由菟絲子、枸杞子等補(bǔ)腎填精的經(jīng)典中藥組成，旨在填精益氣，并促進(jìn)氣血沿HPG軸運(yùn)行。自2010年代初以來的初步臨床觀察表明，清郁養(yǎng)精方及其隨證加減，能提高腎虛型少弱精子癥患者的精子質(zhì)量參數(shù)和妊娠結(jié)局。然而，其潛在機(jī)制尚未完全闡明。

盡管清郁養(yǎng)精方的臨床經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用已有初步記載，但尚缺乏針對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的少弱精子癥 Efficacy 的全面科學(xué)驗(yàn)證，同時(shí)對其入血成分的鑒定以及在分子和組織學(xué)水平上的機(jī)制理解也存在不足。本研究旨在采用多維度方法：建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的少弱精子癥大鼠模型，通過評估精子質(zhì)量和采用ELISA法檢測血清中HPG軸激素水平，以評價(jià)清郁養(yǎng)精方的治療效果。采用ELISA法檢測睪丸組織中關(guān)鍵氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子的水平。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定清郁養(yǎng)精方給藥后吸收入血的原型成分，從而闡明其體內(nèi)藥效成分。采用蘇木精-伊紅染色評估睪丸組織病理學(xué)，并通過蛋白質(zhì)印跡法分析睪丸組織中關(guān)鍵的凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2、Caspase-3和Caspase-9，以闡明潛在的蛋白通路機(jī)制。通過將入血成分鑒定與功能評估、組織病理學(xué)和蛋白通路分析相結(jié)合，本研究為清郁養(yǎng)精方對抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的睪丸組織損傷提供了全面的理解。研究結(jié)果為清郁養(yǎng)精方的臨床應(yīng)用奠定了藥理學(xué)基礎(chǔ)，并有助于更好地理解中醫(yī)藥治療少弱精子癥的機(jī)制。

【結(jié)果部分】

1. 清郁養(yǎng)精方中鑒定的成分類型。

圖 1 清郁養(yǎng)精方（QYYJF）血中原型成分示意圖（a）正離子模式；（b）負(fù)離子模式

2.清郁養(yǎng)精方的化學(xué)結(jié)構(gòu)及裂解規(guī)律。

圖2. 可能的裂解途徑。（a）金絲桃苷；（b）隱丹參酮；（c）原兒茶醛。

圖 3. 可能的裂解途徑。（d）異毛蕊花糖苷；（e）毛蕊花糖苷。

3.清郁養(yǎng)精方顯著改善少弱精子癥大鼠的生精功能。

圖 4. 睪丸組織 HE 染色（200×，比例尺 = 200 μm）。組織病理學(xué)分析顯示，模型組精子發(fā)生嚴(yán)重紊亂，生精小管受損，生精細(xì)胞層減少。在 QYYJF 和左卡尼汀組中，這些病理改變得到顯著改善（見白色方框內(nèi)）。

圖 5. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠睪丸組織重量和精子質(zhì)量（a）雙側(cè)睪丸重量；（b）睪丸指數(shù)；（c）精子密度；（d）精子活力。結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 8）。

圖 6. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠 HPG 軸血清激素水平（a）血清睪酮水平；（b）血清黃體生成素水平；（c）血清卵泡刺激素水平；（d）血清促性腺激素釋放激素水平；（e）血清雌二醇水平。

圖 7. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平和炎癥細(xì)胞因子（a）睪丸組織 SOD 活性；（b）睪丸組織 MDA 含量；（c）睪丸組織 GSH-PX 活性；（d）睪丸組織 ROS 熒光強(qiáng)度；（e）睪丸組織 TNF-α 水平；（f）睪丸組織 IL-6 水平；（g）睪丸組織 IL-1β 水平。

圖 8. 睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及定量結(jié)果（a）Bax；（b）Bcl2；（c）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；（d）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；（e）蛋白表達(dá)定量結(jié)果。

【結(jié)論與討論】

環(huán)磷酰胺破壞了大鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致少弱精子癥的發(fā)生。清郁養(yǎng)精方作為一種中藥復(fù)方，通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素，減輕睪丸組織的氧化損傷和炎癥，并抑制生精細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮補(bǔ)腎填精之效，成為治療少弱精子癥的有效方法。

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