FSAP | 寧波大學(xué)涂茂林副教授等：從酪蛋白中鑒定一種安全有效的抗氧化肽：體外與細(xì)胞水平研究

寧波大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、食品科學(xué)與工程學(xué)院、全省食品微生物與營(yíng)養(yǎng)健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、“浙江—馬來(lái)西亞農(nóng)產(chǎn)品加工與營(yíng)養(yǎng)健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室范碩等從牛酪蛋白中篩選出一種新型抗氧化肽，重點(diǎn)研究其體外抗氧化能力及對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用，該肽表現(xiàn)出有效的2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除能力。這一研究為功能食品和藥品的開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

Introduction

自由基是機(jī)體正常代謝產(chǎn)生的生理反應(yīng)產(chǎn)物，包括ROS和活性氮等。其動(dòng)態(tài)平衡通過(guò)酶系統(tǒng)和抗氧化劑的協(xié)同作用得以維持。然而，當(dāng)多種內(nèi)外不利因素共同作用時(shí)，可能破壞這一調(diào)控系統(tǒng)，導(dǎo)致自由基過(guò)量產(chǎn)生。這些高活性分子會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)氧化應(yīng)激，顯著增加患炎癥、糖尿病、高血壓等疾病風(fēng)險(xiǎn)。此時(shí)外源性補(bǔ)充抗氧化劑尤為重要。然而，丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等合成化合物雖具有優(yōu)異的自由基清除活性，但可能對(duì)肝臟、肺部等器官造成不良反應(yīng)；而VC、VE等天然抗氧化劑則往往受限于高成本和不穩(wěn)定性。因此，尋找新型天然抗氧化劑尤為重要。

越來(lái)越多的研究表明，生物活性肽具有特異性強(qiáng)、來(lái)源廣泛、副作用小等突出優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)療健康領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前在肉類、乳及乳制品、豆類堅(jiān)果及谷物等多種食品原料中均已鑒定出抗氧化肽。酪蛋白約占牛乳總蛋白含量的80%，同樣是抗氧化肽的重要來(lái)源。

Results

1酪蛋白水解物的分子質(zhì)量分布及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）

酪蛋白水解物的分子質(zhì)量分布及肽段組成特征分析如圖1所示。＜3 kDa的組分占比較小（通常分子質(zhì)量＜3 kDa的生物活性肽具有更高抗氧化活性），提示需進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件以提高小分子肽占比，從而增強(qiáng)整體抗氧化活性；肽段組成特征顯示，3～26肽段數(shù)量占主導(dǎo)地位（分子質(zhì)量主要＜3 kDa），這與分子質(zhì)量分布結(jié)果并不矛盾，因?yàn)镠PLC-MS/MS技術(shù)對(duì)高分子質(zhì)量肽段的檢測(cè)存在局限性。

A.酪蛋白水解物的分子質(zhì)量分布；B. HPLC-MS/MS鑒定出的肽長(zhǎng)度和肽個(gè)數(shù)的關(guān)系。

圖1酪蛋白水解物的分子質(zhì)量分布及肽段組成特征分析

2酪蛋白水解物及肽VRYL的體外抗氧化活性

酪蛋白水解物的抗氧化活性如圖2A、B所示。其抗氧化能力隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的IC50約為3.00 mg/mL，F(xiàn)e2+螯合能力在1.5 mg/mL時(shí)達(dá)84.04%，具有較好的抗氧化能力，可能通過(guò)提供電子/氫原子及抑制Fenton反應(yīng)發(fā)揮抗氧化作用。

肽VRYL的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性如圖2C所示，IC50為0.36 mg/mL，具有良好的抗氧化活性，其活性可能源于Tyr的酚羥基供氫作用及Val/Leu疏水側(cè)鏈的穩(wěn)定效應(yīng)。

A.酪蛋白水解物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率；B.酪蛋白水解物的Fe2+螯合能力；C.肽VRYL的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

圖2酪蛋白水解物和肽VRYL的抗氧化活性

3酪蛋白水解物及肽VRYL的安全性分析

酪蛋白水解物和肽VRYL的細(xì)胞毒性和溶血實(shí)驗(yàn)如圖3～4所示。在實(shí)驗(yàn)濃度下，酪蛋白水解物和肽VRYL處理后，RAW264.7的存活率都在100%左右；溶血率都低于5%。表明酪蛋白水解物和肽VRYL都具有高安全性。

A.酪蛋白水解物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活性影響；B～D.酪蛋白水解物的溶血實(shí)驗(yàn)。

圖3酪蛋白水解物的安全性

A.肽VRYL對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活性影響；B～D.肽VRYL的溶血實(shí)驗(yàn)。

圖4肽VRYL的安全性評(píng)估

4肽VRYL的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性

相比于H2O2處理組，通過(guò)肽VRYL的保護(hù)，HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著降低，這表明肽VRYL在細(xì)胞水平上具有抗氧化作用。

A1.對(duì)照組；A2. H2O2處理組；A3～A6.分別為0.075、0.1、0.25、0.5 mg/mL VRYL處理組；B.不同處理組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

圖5肽VRYL對(duì)HepG2細(xì)胞中ROS含量的影響

Conclusion

本研究通過(guò)酶解法制備了酪蛋白水解物，并對(duì)其安全性和抗氧化性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，酪蛋白水解物具有顯著的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、Fe2+螯合能力和較高的生物安全性。通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)，篩選得到一種新型肽VRYL，它不僅具有良好的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，還能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型中的ROS含量，這表明肽VRYL對(duì)氧化應(yīng)激具有良好的保護(hù)作用。本研究有望為抗氧化肽的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

Abstract

This study aimed to investigate the antioxidant potential of bovine casein hydrolysate and a pure peptide screened from it. The casein hydrolysate obtained by pepsin digestion exhibited obvious antioxidant activity in vitro, including potent Fe2+ chelating and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) cation radical scavenging activities. A novel tetrapeptide, VRYL, was predicted and successfully characterized using in silico techniques and showed excellent ABTS cation radical scavenging ability, with a half maximal inhibitory concentration of 0.36 mg/mL, which is significantly lower than that of the original hydrolysate. Moreover, at the cellular level, VRYL effectively protected against H2O2-induced oxidative stress damage in HepG2 cells and significantly reduced intracellular reactive oxygen species levels. The peptide VRYL not only exhibited excellent antioxidant capacity in vitro but also demonstrated its ability to mitigate oxidative stress damage in a cellular model. This study provides a new theoretical basis for the development of casein hydrolysates and their derived peptides in functional foods.

引文格式

Fan S, Yang X, Wang J, et al. Identification of a safe and effective antioxidant peptide from casein:

in vitro

作者介紹

涂茂林副教授

寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院

涂茂林，女，寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，寧波市領(lǐng)軍拔尖人才，主要從事食源性功能因子挖掘及活性機(jī)制分析和益生菌鑒定及包埋遞送相關(guān)研究。目前，共發(fā)表SCI文章50余篇，其中第一作者/通信作者SCI論文25 篇，其他文章5篇，包含1 篇ESI高被引文章；個(gè)人H-Index為25；主持6 項(xiàng)國(guó)家和省市級(jí)基金。申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利11 項(xiàng)；擔(dān)任國(guó)際期刊《Food Science of Animal Products》青年編委，《Frontiers in Nutrition》的客座編輯，《Critical Reviews in Food Science and Nutrition》和《Food Chemistry》等期刊審稿人。

范碩碩士研究生

寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院

范碩，22級(jí)碩士研究生，現(xiàn)就讀于寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，主要研究方向?yàn)樯锘钚噪牡母咝цb定和作用機(jī)制分析。讀研期間，以第一作者在《International Journal of Biological Macromolecules》《Current Research in Food Science》和《Food Science of Animal Products》期刊上發(fā)表論文3 篇；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利1 項(xiàng)，參與校級(jí)學(xué)生科研項(xiàng)目3 項(xiàng)。

文章內(nèi)容由作者團(tuán)隊(duì)提供。

編輯：閻一鳴； 責(zé)任編輯：劉莉

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