FSAP |?加拿大阿爾伯塔大學(xué)吳建平教授等：水溶性蛋黃水解物具有破骨細(xì)胞生成抑制作用

加拿大阿爾伯塔大學(xué)Ilekuttige Priyan Shanura Fernando等假設(shè)蛋黃鹽溶性水解組分（salt-soluble hydrolyzed egg yolk fraction，F(xiàn)C）對破骨細(xì)胞形成與分化具有劑量依賴性抑制作用，旨在深入探究其作用機(jī)制，為開發(fā)改善骨骼健康的功能性食品成分提供依據(jù)。

Introduction

骨骼通過成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的協(xié)同作用持續(xù)進(jìn)行重塑，二者功能失衡會引發(fā)骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥作為常見骨骼疾病，以骨密度降低、骨組織脆弱及骨折風(fēng)險(xiǎn)升高為特征，全球50 歲及以上人群中男性患病率達(dá)4.2%、女性達(dá)18.8%，未來發(fā)病率還將大幅上升。目前臨床治療手段包括雙膦酸鹽、地舒單抗等藥物及非藥物干預(yù)，但存在副作用風(fēng)險(xiǎn)，因此食品來源的生物活性化合物因安全性高、副作用少，成為研究熱點(diǎn)。

生物活性肽可通過多種細(xì)胞信號通路促進(jìn)成骨活性、抑制破骨細(xì)胞生成，其中蛋黃來源肽表現(xiàn)突出——蛋黃肽已被證實(shí)可體外促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，還能提高去卵巢（ovariectomized，OVX）骨質(zhì)疏松大鼠模型的骨密度；蛋黃水溶性部分中的卵黃高磷蛋白（含123 個磷酸絲氨酸殘基，是已知磷酸化程度最高的天然蛋白）及其衍生磷酸肽（phosphopeptides，PPP），可增強(qiáng)鈣結(jié)合能力、促進(jìn)鈣在骨骼中沉積，進(jìn)而促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收。

然而，蛋黃來源肽及其他成分發(fā)揮生物活性的具體機(jī)制仍不明確，且提取純化過程耗時耗力、成本高，制約了規(guī)模化生產(chǎn)。此前研究已制備出3 種蛋黃組分：水溶性組分（water-soluble egg yolk fraction，F(xiàn)A）、鹽溶性組分（salt-soluble egg yolk fraction，F(xiàn)B）及FC，發(fā)現(xiàn)FC及其亞組分FC1（＜3 kDa）可通過調(diào)節(jié)核因子-κB配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）比值，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化、遷移及礦化，同時抑制破骨細(xì)胞生成。

Results

1蛋黃組分對破骨細(xì)胞生成、MAPK通路及破骨細(xì)胞生成因子的抑制作用

破骨細(xì)胞形成抑制：以具有已知破骨細(xì)胞生成抑制作用的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）為陽性對照，在RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型中，F(xiàn)A、FB、FC 3 種蛋黃組分均以劑量依賴性方式抑制破骨細(xì)胞形成。其中，1000 μg/mL FA、100～1000 μg/mL FB及100～1000 μg/mL FC抑制效果顯著；相同劑量（1000 μg/mL）下，F(xiàn)C的抑制作用顯著強(qiáng)于FA和FB，且與OVT相當(dāng)。

MAPK通路抑制：RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成時會激活MAPK通路（含ERK、p38、JNK 3 種關(guān)鍵激酶），1000 μg/mL FC可顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的p38和JNK磷酸化，阻斷通路激活。

破骨細(xì)胞生成因子調(diào)控：RANKL會顯著上調(diào)破骨細(xì)胞生成關(guān)鍵蛋白（TRAF6、c-Fos、NFATc1、組織蛋白酶K）的表達(dá)，而FC預(yù)處理可劑量依賴性降低這些蛋白的表達(dá)水平，高劑量時處理組與未處理組差異顯著，表明FC通過抑制MAPK信號及破骨細(xì)胞特異性蛋白生成，實(shí)現(xiàn)對破骨細(xì)胞形成與分化的抑制。

A. TRAP染色圖像；B.成熟破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)；C. MAPK通路介質(zhì)的相對磷酸化水平；D.破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物的蛋白水平。

圖1蛋黃組分對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的抑制作用及FC對MAPK通路和破骨細(xì)胞生成因子調(diào)節(jié)的影響

2 FC亞組分（FC1、FC2）對破骨細(xì)胞分化的抑制差異

通過3 kDa截留超濾膜將FC分為FC1（＜3 kDa）和FC2（＞3 kDa），二者均以劑量依賴性方式抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化（表現(xiàn)為抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）陽性多核細(xì)胞減少），但FC1抑制活性更強(qiáng)：100～1000 μg/mL FC1抑制效果顯著，1000 μg/mL時TRAP陽性破骨細(xì)胞占比僅為（53.33±9.73）%；而FC2僅在1000 μg/mL 時抑制效果顯著，TRAP陽性破骨細(xì)胞占比為（84.00±5.11）%。免疫熒光染色（小麥胚芽凝集素＋Hoechst 33342）結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，F(xiàn)C和FC1均隨劑量增加而減少多核破骨細(xì)胞形成，且FC1效果更優(yōu)。

A. TRAP染色圖像；B.成熟破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)；C.免疫熒光染色圖像。

圖2 FC1和FC2組分對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的抑制作用

3 FC1對MAPK通路及破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物的抑制作用

MAPK通路抑制：FC1和FC2均以劑量依賴性方式抑制ERK、p38、JNK的磷酸化，但FC1抑制效力更強(qiáng)——100～1000 μg/mL FC1可顯著降低3 種激酶的磷酸化水平，而FC2對JNK的顯著抑制僅在1000 μg/mL時出現(xiàn)，且FC1對JNK磷酸化的抑制效果優(yōu)于FC2。

破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物調(diào)控：RANKL顯著上調(diào)TRAF6、NFATc1、組織蛋白酶K的表達(dá)，F(xiàn)C1在10～1000 μg/mL范圍內(nèi)可顯著降低c-Fos、TRAF6、組織蛋白酶K的表達(dá)，100～1000 μg/mL時可顯著降低NFATc1的表達(dá)；FC2雖也呈劑量依賴性抑制這些標(biāo)志物，但相同劑量下抑制程度弱于FC1，表明FC1在抑制破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物方面發(fā)揮更關(guān)鍵作用。

A.相對磷酸化水平柱狀圖；B～C.免疫印跡圖。

圖3 FC1和FC2對RAW264.7細(xì)胞中RANKL誘導(dǎo)的MAPK通路介質(zhì)表達(dá)的影響

4蛋黃組分FC1抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物表達(dá)

結(jié)果顯示，RANKL刺激可顯著上調(diào)TRAF6、NFATc1及組織蛋白酶K的表達(dá)（P＜0.05），表明破骨細(xì)胞生成過程被成功誘導(dǎo)。對于FC1組分：在10～1000 μg/mL范圍內(nèi)，與對照組相比，c-Fos、TRAF6及組織蛋白酶K的表達(dá)量均顯著降低；且在100 μg/mL和1000 μg/mL下，NFATc1的表達(dá)也顯著下調(diào)（P＜0.05）。

FC2組分同樣能以劑量依賴性方式降低這些破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物的表達(dá)，但在對應(yīng)質(zhì)量濃度下，各蛋白的抑制程度均低于FC1組分，表明FC1亞組分的抑制效果更優(yōu)。這一結(jié)果提示，F(xiàn)C組分中低分子質(zhì)量的成分在抑制破骨細(xì)胞生成關(guān)鍵標(biāo)志物表達(dá)方面發(fā)揮著更重要的作用。

A.相對蛋白水平柱狀圖；B～C. 免疫印跡圖。

圖4 FC1和FC2對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成因子表達(dá)的影響

5蛋黃組分FC1誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，早期凋亡細(xì)胞（對應(yīng)散點(diǎn)圖中的Q3象限）和晚期凋亡細(xì)胞（對應(yīng)散點(diǎn)圖中的Q2象限）比例均隨FC1質(zhì)量濃度增加呈劑量依賴性上升（圖5）。與對照組（早期凋亡細(xì)胞比例為（6.37±1.79）%）相比，10、100、1000 μg/mL FC1處理組，早期凋亡細(xì)胞比例均顯著升高（P＜0.05）。此外，在1000 μg/mL FC1處理下，晚期凋亡細(xì)胞比例為（5.80±1.10）%，顯著高于對照組（P＜0.05）。

流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖顯示，隨著FC1質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞從左下象限（活細(xì)胞，Q4象限）逐漸向Q3象限（早期凋亡）和Q2象限（晚期凋亡）轉(zhuǎn)移。

A～B.早期和晚期凋亡比率柱狀圖；C.流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖。

圖5 FC1對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞凋亡的影響

Discussion

1研究背景與創(chuàng)新性

蛋黃是蛋白質(zhì)與生物活性肽的重要來源，其成分在骨骼健康領(lǐng)域的研究已證實(shí)：蛋黃肽可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞活性、抑制破骨細(xì)胞生成發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松潛力，例如部分去磷酸化的卵黃高磷蛋白水解物可通過MAPK（JNK/p38）或NF-κB p65通路抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。但現(xiàn)有研究對蛋黃水溶性水解物中低分子質(zhì)量成分（如＜3 kDa組分）的破骨細(xì)胞分化抑制作用及信號通路調(diào)控機(jī)制關(guān)注不足，本研究正是基于此前對蛋黃組分（FA、FB、FC）成骨潛力的探索，進(jìn)一步聚焦其抗破骨細(xì)胞生成功能，填補(bǔ)了低分子質(zhì)量蛋黃成分作用機(jī)制的研究空白。

2蛋黃組分FC及亞組分FC1的作用機(jī)制分析

骨骼穩(wěn)態(tài)依賴成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收的平衡，骨質(zhì)疏松的核心特征是破骨細(xì)胞過度活躍導(dǎo)致平衡失衡。本研究采用RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型（成熟的破骨細(xì)胞分化研究模型）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C組分可顯著抑制成熟破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP的活性，且經(jīng)3 kDa超濾分離后，F(xiàn)C1（＜3 kDa）的抑制效果顯著強(qiáng)于FC2（＞3 kDa），這與“無脂水溶性蛋黃蛋白可抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化”的既往研究結(jié)論一致，同時拓展證實(shí)低分子質(zhì)量成分（如小分子肽）是FC發(fā)揮作用的關(guān)鍵。

從信號通路來看，RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成時會激活NF-κB與MAPK 2 條核心通路，其中MAPK通路（含ERK、p38、JNK）調(diào)控破骨細(xì)胞的分化與存活。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C1可劑量依賴性抑制ERK、p38、JNK的磷酸化，且對ERK磷酸化的抑制效果優(yōu)于FC2——ERK激活可促進(jìn)c-Fos、NFATc1等破骨細(xì)胞生成關(guān)鍵基因的表達(dá)，因此FC1對ERK的強(qiáng)效抑制可進(jìn)一步減少下游轉(zhuǎn)錄因子及功能蛋白（如組織蛋白酶K）的表達(dá)，這也是其抗破骨細(xì)胞生成活性更強(qiáng)的重要原因。

此外，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞凋亡是抑制骨吸收的關(guān)鍵策略（如雙膦酸鹽、雌激素等藥物均通過此機(jī)制起效）。本研究證實(shí)FC1可誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞凋亡，且凋亡比例隨濃度升高而增加，這一效果與FC1對MAPK通路的抑制密切相關(guān)——MAPK通路在破骨細(xì)胞存活中起核心作用，通路活性降低會直接觸發(fā)凋亡程序，進(jìn)一步補(bǔ)充了蛋黃成分抗骨吸收的機(jī)制維度。

3研究局限性與未來方向

本研究僅通過體外細(xì)胞模型（RAW264.7細(xì)胞）驗(yàn)證了FC及FC1的活性，未能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境（如消化吸收、組織分布等）。因此，后續(xù)需優(yōu)先開展體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)（如采用去卵巢OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型），評估FC組分在整體動物水平的功效；同時，需明確FC1中發(fā)揮活性的具體成分（如特定小分子肽序列），并分析其吸收、分布、代謝、排泄特征，為其轉(zhuǎn)化為功能性食品成分或膳食補(bǔ)充劑提供更全面的理論支持。

Conclusion

3 種水溶性蛋黃組分（FA、FB、FC）中，F(xiàn)C對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成具有最顯著的劑量依賴性抑制作用；其亞組分FC1（< 3kDa）的抑制活性顯著優(yōu)于FC2（＞3 kDa），證實(shí)FC中低分子質(zhì)量成分是抗破骨細(xì)胞生成的核心活性物質(zhì)。FC1通過多重途徑抑制破骨細(xì)胞功能：一是下調(diào)MAPK信號通路（ERK、p38、JNK）的激活，阻斷破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)；二是劑量依賴性降低破骨細(xì)胞生成關(guān)鍵標(biāo)志物（TRAF6、c-Fos、NFATc1、組織蛋白酶K）的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的成熟與功能實(shí)現(xiàn)；三是誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞凋亡，減少功能性破骨細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步削弱骨吸收能力。

本研究證實(shí)水溶性蛋黃水解物（尤其是FC1）具有改善骨骼健康的潛力，可作為開發(fā)骨質(zhì)疏松管理相關(guān)功能性食品成分或膳食補(bǔ)充劑的候選。未來需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體功效，并明確FC1中活性成分的結(jié)構(gòu)與代謝特征，推動其從基礎(chǔ)研究向?qū)嶋H應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

Abstract

Eggs contain various bioactive proteins that influence bone health. This study investigated the effects of three water-soluble egg yolk fractions (FA, FB, and FC) and subfractions of FC (FC1 (< 3 kDa) and FC2 (> 3 kDa)) on osteoclastogenesis. FC and its subfractions showed promising osteoclastogenesis inhibitory effects by suppressing osteoclast differentiation in receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced RAW264.7 macrophages. Furthermore, they inhibited RANKL-induced activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway mediators and production of key osteoclastogenic markers in a dose-dependent manner. At 1 000 μg/mL, the FC1 and FC2 fractions resulted in (53.33 ± 9.73)% and (84.00 ± 5.11)% tartrate resistant acid phosphatase-positive osteoclasts, respectively, indicating that the FC1 fraction exhibited stronger inhibitory activity on osteoclastogenesis than the FC2 fraction. Furthermore, the FC1 fraction induced the apoptosis of mature osteoclasts, significantly increasing the proportion of cells in early apoptosis at 10, 100, and 1 000 μg/mL doses ((21.50 ± 1.93)%, (29.17 ± 2.04)%, and (40.40 ± 1.91)%, respectively) and late apoptosis at 1 000 μg/mL ((5.80 ± 1.10)%) compared to the control ((6.37 ± 1.79)% early apoptosis, (0.33 ± 0.58)% late apoptosis). While this study demonstrated the involvement of the MAPK pathway, further investigation is required to confirm their activity

in vivo

引文格式

Fernando IPS, Wu J. Water-soluble egg yolk hydrolysate shows osteoclastogenesis inhibitory effects. Food Science of Animal Products, 2025, 3(3): 9240125. https://doi.org/10.26599/FSAP.2025.9240125

編輯：張慶芬、閻一鳴； 責(zé)任編輯：劉莉