【前沿&進展】J Virol | 藍柯教授團隊成功揭示卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）RTA調控病毒裂解復制新機制

近日，高致病性病毒與生物安全全國重點實驗室/武漢大學生命科學學院/泰康生命醫學中心藍柯研究組在國際學術期刊Journal of Virology發表了題為Repression of EEF1D by KSHV RTA Promotes Viral Lytic Reactivation的研究論文。該研究揭示了卡波氏肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）裂解復制開關分子RTA作為轉錄抑制因子下調宿主抗病毒蛋白EEF1D從而促進病毒裂解復制的新機制。

卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV），又稱人類皰疹病毒 8 型（HHV-8），是導致卡波西肉瘤（KS）、原發性滲出性淋巴瘤（PEL）和多中心卡斯特曼病（MCD）的主要病原體。KSHV 在宿主體內主要以潛伏感染（Latency）狀態存在，此時病毒基因組保持靜默，僅表達極少數基因以逃避宿主免疫清除。然而，在特定環境刺激下，病毒會進入裂解性激活（Lytic Reactivation）階段。這一過程對于病毒的水平傳播及致病性至關重要，因為大量的病毒顆粒產生會導致細胞裂解和炎癥反應。這一轉變的“總開關”是病毒編碼的復制與轉錄激活因子（RTA）。雖然 RTA 的促激活作用已被廣泛研究，但宿主細胞如何通過限制 RTA 的功能來維持潛伏狀態，以及 RTA 如何反過來瓦解這些宿主“防御枷鎖”，仍是病毒學領域的核心課題。
本研究聚焦于真核翻譯延伸因子EEF1D（eukaryotic translation elongation factor 1δ）。傳統上認為 EEF1D 參與蛋白質合成，但其在病毒生活周期調節中的非經典功能此前尚不明確。本文采用了分子生物學、生物化學與遺傳學相結合的多維度實驗方案，即（1）功能篩選與驗證： 利用 CRISPR/Cas9 基因敲除技術和過表達實驗，觀察 EEF1D 水平變化對 KSHV 裂解基因表達（如 ORF50/RTA, ORF45, K8）及病毒滴度的影響。（2）蛋白質相互作用分析： 通過共免疫沉淀（Co-IP）和免疫熒光共定位實驗，檢測 RTA 蛋白與 EEF1D 之間的物理結合。（3）轉錄調控研究：采用雙熒光素酶報告基因實驗（Luciferase Assay）和定量 PCR（RT-qPCR），評估 RTA 是否在轉錄水平上抑制 EEF1D基因的啟動子活性。（4）蛋白質穩定性實驗：使用蛋白質合成抑制劑（放線菌酮，CHX）處理細胞，觀察 RTA 存在下 EEF1D 蛋白的降解動力學，并利用蛋白酶體抑制劑（MG132）探究其降解途徑。（5）進化保守性分析： 對其他靈長類（如恒河猴 rKSHV）及嚙齒類（如 MHV-68）的 γ-皰疹病毒同源蛋白進行對比實驗，分析該機制的進化演變。
實驗結果顯示，敲除 iSLK-RGB 等細胞系中的 EEF1D 會顯著增強 KSHV 的裂解性基因表達，并增加子代病毒的產生。相反，過表達 EEF1D 則能有效抑制 RTA 誘導的病毒激活。這表明 EEF1D 在生理條件下起到了“分子剎車”的作用，維持病毒的潛伏狀態。
研究發現，KSHV 的 RTA 蛋白演化出了一種極為高效的策略，從兩個層面清除 EEF1D 的阻礙，即RTA 對 EEF1D 的雙重打擊機制：

• 轉錄抑制：RTA 能夠結合在 EEF1D 基因的啟動子區域，通過抑制其轉錄活性，從源頭上減少 EEF1D mRNA 的產量。

• 翻譯后降解：RTA 充當了 E3 泛素連接酶或其招募者，與 EEF1D 直接結合并誘導其通過泛素-蛋白酶體途徑發生降解。這是首次證明 RTA 具有靶向降解該類延伸因子的能力。

通過截短體突變實驗，研究確定了 RTA 的 C 端轉錄激活域對其抑制 EEF1D 至關重要。同時，RTA 的特定基序負責與 EEF1D 結合，這一發現為未來篩選阻斷該相互作用的小分子藥物提供了靶點。研究進一步發現，這種“RTA-EEF1D 拮抗軸”在人類 KSHV 和恒河猴 rKSHV 中高度保守，但在鼠類 γ-皰疹病毒 MHV-68 中并不存在。這暗示該機制是靈長類皰疹病毒在長期進化中為了適應宿主環境而獲得的特有策略。

RTA抑制EEF1D以促進KSHV裂解復制的機制示意圖

由于既往尚沒有KSHV RTA作為轉錄抑制因子的報道，團隊深入研究了RTA轉錄抑制EEF1D的功能機制，發現這一抑制作用是由RTA通過與DNA甲基轉移酶DNMT3A相互作用，并與另一轉錄因子PATZ1形成復合物，最終由PATZ1將該復合物招募至EEF1D的啟動子區域從而引起EEF1D啟動子超甲基化和轉錄抑制。有趣的是，KSHV RTA作為轉錄抑制因子抑制EEF1D轉錄的現象在靈長類γ皰疹病毒中具有保守性。

總之，該研究首次揭示了KSHV RTA可作為轉錄抑制因子下調宿主抗病毒蛋白從而促進病毒裂解復制，拓展了對RTA功能的認識，并為理解KSHV再激活裂解復制機制提供了新的見解。

武漢大學生命科學學院博士研究生向敏為該論文的第一作者，藍柯教授為通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃等項目的資助。