諾獎得主山中伸彌回顧并展望iPSC研究二十年：從發現到多樣化應用

編譯丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

2006 年，山中伸彌（Shinya Yamanaka）和他的學生兼助手高橋和利（Kazutoshi Takahashi）在 Cell 期刊發表論文【1】，首次發下只需表達四個因子——Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，就能從小鼠胚胎或成纖維細胞中誘導出多能干細胞，他們將其命名為誘導多能干細胞（iPSC），這一發現為山中伸彌贏得了 2012 年諾貝爾生理學或醫學獎。

這一最初的意外發現迅速改變了全球的干細胞生物學和再生醫學，如今，二十年過去了，我們對細胞重編程和多能性的分子機制有了深刻理解。iPSC 技術也不斷發展——變得更安全、更高效、更通用，正成為從疾病建模、藥物發現到再生療法及抗衰老研究等廣泛應用的基礎。

近日，諾貝爾獎得主山中伸彌教授在Cell Stem Cell期刊發表了題為：Two decades of induced pluripotent stem cell research: From discovery to diverse applications 的文章【2】。

在這篇文章中，山中伸彌教授回顧了 iPSC 的科學歷程，強調了對重編程理解的關鍵里程碑，并探討了 iPSC 不斷擴大的臨床和社會影響。

“山中博士，請來看看這些細胞。它們看起來像胚胎干細胞（ESC）。”

那是 2005 年的夏天，高橋和利沖進我的辦公室宣布了這件事。他將 24 個候選基因——被鑒定為在小鼠胚胎干細胞中高表達——引入了小鼠胚胎成纖維細胞。為了監測重編程，我們改造了這些成纖維細胞，使得它們只有在激活胚胎干細胞（ESC）特異性基因表達時才能在 G418 篩選下存活。在顯微鏡下，我看到了幾個在形態上類似于小鼠胚胎干細胞的克隆。我告訴高橋：“別激動。這很可能是污染。”當然，后來的事實證明，我錯了。

2005 年夏天觀察到的首批 iPSC 克隆之一

我大約在 2000 年第一次成為獨立研究員時，開始認真思考細胞重編程。核移植實驗和轉錄因子介導的細胞命運轉換研究表明，分化狀態原則上是可以逆轉的。然而，多能性——細胞可塑性的最極端形式——是否能僅由確定的因子誘導，這完全不清楚，我當時認為，解決這個問題可能需要數十年之久。

山中伸彌

讓我有信心嘗試這個實驗的想法是，多能性是由一個相對較小的核心調控網絡而非數百個獨立組件來維持的。胚胎細胞似乎由數量有限的、通過強化反饋回路連接的轉錄因子所穩定。如果是這樣，強制表達正確的組合可能足以重置細胞身份。盡管如此，我們最初并未期望實驗會成功。我們最初的計劃是使用逆轉錄病毒 cDNA 文庫進行大規模篩選，而 24 因子實驗是作為驗證我們篩選系統的試點構思的。如果它失敗了，我們會繼續進行基于文庫的無偏倚發現。

高橋重復了實驗，并持續獲得類似的克隆。通過系統性地剔除，他將基因集縮小到四個——Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc（合成為OSKM）。由這四個因子誘導的細胞表現出多能干細胞的特性。這就是誘導多能干細胞（induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）的誕生。

到我們向Cell期刊投稿時，我們已經在實驗室確認了 iPSC 誘導的可重復性。然而，我們仍擔心其他人使用不同的手法、試劑和設備是否能重復出來。我們的擔憂被證明是多余的——在不到一年時間里，世界各地的多個實驗室成功利用小鼠和人類細胞生成了 iPSC。胚胎干細胞研究從小鼠過渡到人類用了 17 年，而建立在胚胎干細胞研究基礎上的 iPSC 技術僅用 1 年就完成了這一過渡。此后，數千項研究探索了這項技術的幾乎每個方面，從分子機制到轉化應用。

在這篇文章中，山中伸彌教授重點介紹了塑造我們對 iPSC 重編程理解和醫學應用的里程碑式發現，并討論了二十年以來不斷涌現的廣泛的當前和未來應用。

重編程機制、iPSC 及相關技術的醫學應用的標志性論文

重訪重編程效率：對“精英”與“隨機”辯論的細致解析

重編程最初令人震驚，不僅因為它可能實現，還因為它效率低下。早期報告指出，只有極少部分的細胞成功重新激活了多能性程序。這種低效引發了一場關于“精英模型”和“隨機模型”支持者之間的熱烈辯論。

精英模型假設，在一個異質性群體中，只有稀有細胞——可能是祖細胞或類干細胞——保留了固有的可塑性，使其能夠對 OSKM 做出反應。這些細胞被認為擁有更易接近的染色質環境或更有利的增殖能力。

隨機模型提出了一個更激進的想法：所有體細胞都具有重編程的能力，但該過程需要一系列罕見的分子事件，而這些事件發生的概率很低。從這個角度來看，低效率反映了任務的復雜性，而不是起始群體的局限性。

隨著該領域數據的積累，情況變得清晰——兩種模型都捕捉到了部分真相。次級 iPSC 誘導系統的發展極大地促進了數據積累。重編程的早期階段是高度異質性的。單細胞轉錄組學分析顯示，細胞會經歷不穩定的中間狀態，其特征是體細胞身份的局部丟失和早期多能性相關基因的零星激活。只有其中一些細胞進展到足以激活核心多能性網絡，而其他細胞則轉向死胡同或恢復為體細胞表達模式。

然而，該領域也了解到，體細胞的初始狀態至關重要。角質形成細胞的重編程效率遠高于成纖維細胞，因為它們的染色質環境天生就更容易接近。血液祖細胞比重編程末期的淋巴細胞更容易。衰老、氧化應激、線粒體功能障礙和代謝靈活性改變都會影響重編程的易感性。因此，雖然隨機性主導早期事件，但體細胞狀態與多能性之間的表觀遺傳“距離”決定了細胞穿越重編程“景觀”的可能性。

這種細致的理解強調了內在細胞特性與概率性轉變之間的相互作用。重編程既非完全確定性，也非完全隨機——它是一個受起始狀態和重塑身份的分子事件序列共同影響的混合過程。

細胞重編程的機制：解碼可塑性的邏輯

重編程是一個戲劇性的生物學事件。它不僅需要抑制體細胞身份，還需要重建一個類似于早期胚胎的多能狀態。這種轉變通過轉錄重組、表觀遺傳重塑、代謝重連和細胞結構變化的交織波次展開。

OSKM 誘導后的最初幾天內會發生第一個可觀察到的轉變。體細胞轉錄因子開始失去主導地位，其增強子逐漸關閉。同時，細胞經歷間質-上皮轉化（MET），這一事件令該領域感到驚訝，因為它揭示了細胞粘附和極性信號對于實現向多能性轉變至關重要。MET 反映了細胞遠離成纖維細胞身份、轉向更類似上皮、胚胎樣狀態的過程。角質形成細胞的重編程效率高于成纖維細胞，因為它們本質上是上皮性的，繞過了對 MET 的需求。

這種轉變通常伴隨著代謝變化。嚴重依賴氧化磷酸化的體細胞減少了線粒體活性，并開始傾向于糖酵解，這是多能干細胞的一個標志。線粒體自身也經歷形態重構，變得更小、更不細長——這是代謝轉變的視覺表現。

重編程需要染色質的廣泛重構。多能性基因通常被鎖定在帶有 H3K9me3 或 DNA 甲基化的抑制性染色質中。OSKM 的表達啟動了染色質開放的緩慢、復雜過程。TET 酶催化多能性增強子的去甲基化，組蛋白修飾復合物去除抑制性標記。染色質重塑因子例如 BRG1 有助于重新定位核小體，為多能性基因激活創造有利環境。

體細胞增強子的去除和多能性增強子的逐漸出現，凸顯了染色質結構與轉錄之間的動態相互作用。增強子-啟動子距離發生變化，環狀相互作用重新排列，先前沉默的基因組區域為激活做好準備。

核心多能性調控因子的激活代表了重編程的一個臨界點。Nanog、Oct4、Sox2 和 Esrrb 形成相互連接的反饋回路，穩定了多能性身份。一旦這個網絡建立，細胞就從一種不穩定的中間狀態過渡到一個更具決定性的階段，此時結果變得可預測。

在此階段，細胞周期加速，G1 檢查點縮短，DNA 修復通路進行調整以支持多能細胞特有的增殖增加。染色質整體上變得更易接近，反映了一個為快速分化成多種譜系做好準備的多能性基因組。

隨著多組學技術的成熟，人們明顯看到僅靠轉錄因子并不能控制重編程。小 RNA 在從體細胞向多能身份轉變過程中微調基因表達。RNA 結合蛋白影響對身份轉換至關重要的剪接模式，而長鏈非編碼 RNA 調控增強子活性并穩定中間狀態。這些調節因子共同幫助編排定義重編程的復雜分子事件之舞。

隨著單細胞轉錄組學、染色質可及性測序、甲基化譜分析、蛋白質組學和代謝組學的整合，該領域現在接近對重編程軌跡的全面理解。最佳輸運模型等計算框架允許研究人員重建數千個單個細胞的軌跡，揭示替代路徑、繞行和瓶頸。

重編程不再被視為一條簡單的通路，而是被視為一個由轉錄、染色質、代謝和細胞生理學相互作用塑造的多維“景觀”。

iPSC 的醫學應用：從早期質疑到成熟的轉化渠道

從一開始，iPSC 在再生醫學領域就擁有巨大潛力。然而，從概念到臨床的旅程遠非一帆風順。早年充滿了對安全性、可重復性、基因組完整性和分化潛能的合理擔憂。隨著時間的推移，謹慎的實驗和方法論的改進將這些挑戰轉化為創新的機會。

早期的 iPSC 生成依賴于有插入突變風險的整合型病毒載體。這些方法雖然有效，但引發了臨床應用方面的擔憂。非整合系統的開發——附加型質粒、腺病毒、仙臺病毒、piggyBac、合成 mRNA，以及最終基于小分子的方法——代表了一個轉折點。這些平臺不僅消除了基因組整合的風險，還簡化了下游的質量控制并提高了可擴展性。

初步研究報告了 iPSC 中令人擔憂的拷貝數變異和突變水平。然而，更深入的分析揭示，大多數是預先存在的體細胞嵌合突變，而非重編程的假象。盡管如此，這些發現促使廣泛采用嚴格的基因組質量控制流程。深度測序、甲基化譜分析、核型分析和線粒體基因組分析現在構成了 iPSC 表征的標準組成部分。

殘留表觀遺傳記憶——供體細胞特異性甲基化模式的持續存在——也通過偏向分化潛力構成了挑戰。重編程動力學、傳代方案和因子表達的改進已在很大程度上解決了這些問題，產生的 iPSC 在分子和功能特性上與胚胎干細胞高度相似。

基因匹配比較表明，人類胚胎干細胞和 iPSC 在分子和功能上基本等同，遺傳背景是表觀差異的主要混雜因素。盡管如此，細胞系間的變異和不完全的重編程事件——特別是在印記、X 染色體狀態和高階基因組程序等特定表觀遺傳特征方面——可以以情境依賴的方式影響表型。

從 iPSC 和胚胎干細胞獲得成熟細胞類型是該領域早期的瓶頸之一。初始的分化方案產生了類似于胎兒而非成體組織的細胞。隨著時間的推移，發育生物學的進步使得能夠創建逐步的方案，以越來越精確地重述胚胎信號通路。類器官技術通過提供模擬體內微環境的 3D 環境，進一步改善了分化結果。

如今，iPSC 來源的心肌細胞表現出更成熟的表型，可以從人類 iPSC 來源的類器官芽中生成血管化和功能性的肝組織，并且 iPSC 來源的神經元形成功能性突觸網絡。雖然完美的成體樣成熟仍然是一個前沿領域，但該領域已經從原理證明演示發展到高度復雜的細胞模型。

一個成熟領域的標志之一是全球標準的發展。iPSC 領域很早就接受了這一必要性，采用了多能性評分卡、標準化報告框架和符合良好生產規范的工作流程。國際聯盟現在協調最佳實踐，以確保全球分發的 iPSC 細胞系符合一致的基準，例如國際干細胞庫倡議和人類多能干細胞注冊中心。

基于 iPSC 的再生療法：從概念承諾到臨床現實

臨床前研究證實，iPSC 來源的細胞可以在宿主組織內存活、整合并發揮功能。在帕金森病模型中，移植的多巴胺能神經元恢復了多巴胺的產生并改善了運動功能。在心臟損傷模型中，iPSC 來源的心肌細胞與宿主心肌同步。來自 iPSC 的視網膜色素上皮細胞表現出結構性整合和對光感受器的支持。

這些成功為推進到首次人體試驗提供了必要的依據。早期的基于 iPSC 的試驗，一個用于年齡相關性黃斑變性，另一個用于帕金森病，不僅證明了可行性，也證明了自體 iPSC 來源移植物安全性。這些試驗突顯了細致制造、長期監測和基因組篩查的重要性——所有這些要素后來都被納入了全球臨床實踐。

在這些早期試驗之后，臨床項目迅速擴展。已使用 iPSC 和胚胎干細胞進行了超過一百項臨床試驗。其中一些已發表的有希望的結果。角膜上皮細胞為治療失明帶來了新希望。多巴胺能祖細胞已進入帕金森病的臨床試驗，其中 iPSC 和胚胎干細胞來源的細胞迄今顯示出相當的安全性和鼓舞人心的療效信號。需要在更大的患者隊列中進行更長期的隨訪，以確定持久性、療效和廣泛的臨床可行性。

雖然自體療法在概念上很吸引人，但其生產緩慢且昂貴。人類白細胞抗原純合 iPSC 庫的創建——匹配國家大部分人口的供體細胞系集合——為可擴展的同種異體療法打開了大門。這些細胞可以預先制備、經過質量測試并儲存以供立即臨床使用。同時，免疫工程已經產生了具有降低免疫原性的“通用” iPSC 細胞系，為真正“現貨型”的再生產品提供了可能性。

iPSC 療法的臨床興起帶來了倫理挑戰，這些挑戰與器官移植和基因治療中看到的類似，但有其獨特細微差別。由于 iPSC 可以從任何個體產生，同意、隱私和數據治理的問題變得尤為重要。隨著再生技術變得更加強大和廣泛應用，公眾參與對于保持信任仍然至關重要。

疾病建模和藥物發現：培養皿中的人類生物學

如果再生療法代表了 iPSC 科學的一個支柱，那么疾病建模則代表了另一個——可以說是當前影響最廣泛的一個。

患者特異性 iPSC 模型使得能夠研究那些因難以獲取原代人體組織而以前無法觸及的疾病。肌萎縮側索硬化癥、脊髓性肌萎縮癥和帕金森病模型表現出標志性的神經元變性。長 QT 綜合征心肌細胞顯示出與心律失常風險相關的電生理特征。這些早期成功證明，iPSC 來源的細胞可以重述有意義的疾病表型。早期臨床試驗的結果支持基于 iPSC 的方法在藥物發現，特別是藥物再利用方面的潛力。

該領域迅速超越了單基因疾病。精神分裂癥、雙相情感障礙和自閉癥等精神疾病已使用 iPSC 來源的神經培養物和類器官進行建模，揭示了突觸形成、網絡活動和發育軌跡方面的細微差異。復雜的心臟疾病、代謝紊亂和免疫功能障礙都已使用類似方法進行了探索。

類器官為疾病建模引入了新的維度。繼笹井芳樹在視網膜類器官的開創性工作（2011 年發表于Nature期刊）之后，其他團隊開發了重現皮質分層和神經元遷移方面的大腦類器官，以及為研究囊性疾病、感染和上皮功能障礙提供平臺的腎臟和腸道類器官。將類器官融合成“組裝體”使得能夠研究長程相互作用，例如中間神經元從前腦腹側遷移到皮質。

iPSC 與 CRISPR 基因組編輯的整合徹底改變了因果推理。通過比較僅在一個致病性變異上不同的同基因對，研究人員可以在沒有混雜背景變異的情況下，識別基因損傷的直接后果。這一策略已經闡明了包括心肌病、自閉癥譜系障礙和代謝疾病在內的多種疾病的機制。

iPSC 來源的組織現在作為藥物發現和安全性測試的平臺。心肌細胞可以預測致心律失常潛力，肝細胞評估代謝和毒性反應，神經培養物提供神經毒性信息。在新發傳染病暴發期間，iPSC 來源的組織為病毒嗜性和宿主反應提供了窗口。

包含不同祖先來源供體的大型 iPSC 生物樣本庫對于捕捉人類遺傳變異的全譜至關重要。現有的儲存庫顯示出強烈的歐洲血統偏向，突顯了需要更廣泛的代表性以支持公平的發現。使用大型 iPSC 隊列的研究表明，遺傳變異塑造細胞表型，包括基因調控和應激反應。由于遺傳背景影響治療反應，多樣化的 iPSC 生物樣本庫為推進個性化醫療和人類功能基因組學提供了必要的基礎設施。

iPSC 及相關技術的多樣化應用

iPSC 科學的擴展視野

雖然 iPSC 常與治療和建模相關，但它已經影響了一系列令人驚訝的科學領域。

來自瀕危物種的 iPSC 為保存遺傳多樣性和研究在無法進行實驗的有機體中的發育軌跡提供了工具。使用靈長類動物 iPSC 的比較研究揭示了早期神經發育、突觸成熟和免疫反應方面的物種特異性差異。

類原腸胚（Gastruloid）和類囊胚（Blastoid）重建了否則在人類中無法獲得的早期發育事件。這些模型闡明了原腸胚形成、軸特化和胚層形成的機制。體外配子發生將iPSC應用擴展到生殖生物學，允許研究生育通路和未來潛在的不孕癥治療方法。

最近，將 iPSC 來源的神經元網絡與電子系統耦合的工作，產生了能夠學習模式、響應刺激和適應行為的混合結構。這些系統挑戰了生物智能與人工智能之間的傳統區別，引發了關于計算、認知和工程生命系統倫理界限的深刻問題。

也可以公平地說，向多能性重編程的發現有助于促進直接譜系重編程的發展。證明確定的轉錄因子可以超越穩定的體細胞身份，從根本上改變了該領域看待細胞命運的方式，為將一種分化狀態直接轉換為另一種狀態的想法打開了大門。隨后在誘導神經元、心肌細胞和其他譜系方面的工作建立在 iPSC 研究期間確立的概念和技術基礎之上，即使這些方法遵循不同的機制路徑。

也許最引人深思的前沿領域之一是“返老還童”生物學，部分重編程——短暫暴露于 OSKM 或修飾的因子變體——提供了一種重置表觀遺傳年齡而不完全抹去細胞身份的方法。動物模型中的早期研究表明，這種方法可以恢復代謝彈性、逆轉衰老的分子標記并改善組織功能。如果這些發現能安全地轉化到人類細胞和組織，部分重編程可能有助于解決與年齡相關的疾病，不是通過治療癥狀，而是通過恢復年輕的細胞狀態。這對公共衛生、長壽和慢性病管理的影響是深遠的，并且需要我們仔細考慮其治療前景和潛在風險，例如致瘤性。

iPSC 技術另一個引人深思的擴展是跨物種器官發生，其目標是通過囊胚互補在大型動物宿主（例如豬）中生成人類器官。在初始多能狀態方面的進展可能使人類 iPSC 在豬和羊胚胎中發揮貢獻作用。盡管主要的生物學和倫理挑戰仍然存在，但基因組工程和發育控制方面的持續進展，使得這種方法作為解決器官短缺問題的潛在策略，仍保持著人們的興趣。

展望：未來二十年

隨著 iPSC 領域進入其第三個十年，干細胞生物學、計算、合成生物學和轉化醫學之間的界限正在消融。下一個時代將不僅僅定義為對重編程或分化方案的漸進式改進，而是由傳統上獨立發展的學科的更深層次整合來定義。在這種融合的核心，存在著一個簡單而深刻的問題：如果我們能控制細胞身份，我們是否也能預測、設計甚至優化它？

即將到來的最具變革性的發展之一是將人工智能整合到干細胞生物學中。多組學數據集現在以前所未有的分辨率捕捉細胞的轉錄、表觀遺傳、代謝和結構狀態。這些數據集對僅憑直覺而言過于復雜，但在其上訓練的人工智能驅動模型已經開始揭示命運決定中的隱藏模式。這些系統可能很快就能預測哪些細胞最容易被重編程，識別成功轉變的最早分子特征，甚至提出繞過經典轉錄因子組合的合成路徑。研究人員可能有一天會在計算機中模擬重編程“景觀”，在體外驗證最有希望的候選方案之前，測試數千個假設的因子組合。

合成生物學也準備同樣戲劇性地重塑該領域。可編程轉錄因子、基于 CRISPR 的表觀遺傳修飾劑和合成基因回路的進步，允許越來越精確地操縱細胞身份。不難想象，多能性程序可以用小分子開啟和關閉，或者分化方案由感知并實時糾正偏差的工程反饋回路引導。安全回路可以防止不受控制的生長，而合成增強子可以穩定在歷史上難以分化的組織中的譜系定向。這些創新預示著一個未來，其中干細胞的行為不僅僅是觀察或被推動，而是被設計。

生物制造——常常被低估的轉化細胞療法支柱——也將經歷深刻變化。封閉系統、自動化培養平臺將減少變異、提高可擴展性并增強安全性。這些系統將允許持續監測多能性標記、代謝狀態和基因組完整性，將細胞生產從一種手工過程轉變為工業化過程。經過工程改造以逃避免疫排斥的通用供體細胞，可能會極大地擴展獲得再生療法的機會，將臨床實踐從定制治療轉向易于部署的現成解決方案。或者，封閉和自動化系統可能使以合理的成本和時間，為每個患者生成自體 iPSC 成為可能。根據要移植的細胞類型以及患者的免疫和系統狀況，可能需要自體 iPSC。

這些科學進步帶有倫理、社會和哲學內涵。隨著 iPSC 衍生系統開始涉及早期人類發育、生殖、認知和環境管理的方面，社會將被迫面對超出常規生物倫理學范疇的問題。

合成的胚胎樣模型挑戰我們對發育界限的定義。體外配子發生引發了關于親子關系、繼承和生殖自主權的問題。將神經元與計算硬件耦合的生物混合系統可能引發關于意識、學習和工程化生物網絡的道德地位的新辯論。甚至保護生物學——iPSC 可以幫助滅絕物種復活或拯救瀕危物種——也提出了關于生態責任和人類干預的長期后果的問題。

應對這些問題不僅需要科學專業知識，還需要持續的公眾對話、透明的監管框架以及對全球公平的承諾。獲取先進的再生療法必須在不同人口統計學和地理區域之間是公平的，不依賴于支付能力或與先進醫療中心的接近程度。同樣，國際標準將有必要管理 iPSC 衍生材料的創建、共享和治療使用。

在許多方面，iPSC 的故事是現代科學的縮影：證明了好奇心驅動的研究、跨學科合作以及挑戰根深蒂固假設的意愿的力量。始于單個實驗室的意外觀察，已經重塑了生物學和醫學的輪廓。如果說過去二十年揭示了細胞命運之間的障礙比曾經想象的更具滲透性，那么未來二十年將展示生物學、技術和社會之間的界限同樣具有流動性。未來的挑戰是以想象力、謹慎和對我們正在創造的世界的共同責任感來利用這種新興潛力。

機器人技術、人工智能和機器學習的進步，將日益自動化實驗并加速數據分析，從根本上改變科學家的日常工作流程。然而，變革性的發現將繼續依賴于人類的好奇心、直覺和對非傳統思想的追求意愿，而技術將作為創造性實驗思維的有力放大器，而非替代品。

論文鏈接：

1. https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(06)00976-7

2. https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(26)00073-1