沈陽藥科大學，最新Science子刊，被Nature亮點報道：用豬精液制成眼藥水，穿透屏障，實現無創治療！

精液來源外泌體開辟眼底病無創治療新范式

視網膜母細胞瘤（RB）作為兒童最常見的眼內惡性腫瘤，因其位于視網膜的特殊位置以及眼組織的精細結構，長期以來面臨嚴峻的治療挑戰。目前的治療手段，如玻璃體內注射、放療、冷凍療法和全身化療，常導致嚴重的眼部結構損傷和全身毒性反應，而對于存在眼外擴散風險的患者，眼球摘除術仍是無奈之選，這意味著永久性的視力喪失。這些局限性凸顯了開發既能有效將藥物遞送至眼后段，又能最大程度減少副作用的無創、靶向治療的迫切需求。眼后段受到血-視網膜屏障和角膜上皮等多重生物屏障的保護，嚴重限制了治療藥物的滲透，使得無創給藥成為眼科領域的一大難題。

沈陽藥科大學張宇教授團隊利用精液來源的外泌體（SEVs）作為藥物載體，實現無創的眼底遞送。研究發現，SEVs 憑借其表皮生長因子（EGF）的表達，能夠可逆地打開眼組織屏障的緊密連接，通過角膜和結膜雙重途徑高效到達眼后段。基于這一發現，研究團隊構建了 FA-SEVs@CMG 滴眼液，將葉酸（FA）修飾的 SEVs 與一種由碳點（CDs）、二氧化錳（MnO?）和葡萄糖氧化酶（Gox）組成的納米酶系統（CMG）相結合。該滴眼液利用 SEVs 優異的穿透能力和 FA 的靶向作用，將藥物高效遞送至視網膜母細胞瘤細胞。內化后的 CMG 系統誘導強烈的氧化應激，破壞自噬-凋亡平衡，觸發腫瘤細胞的自我毀滅。在體內實驗中，FA-SEVs@CMG 有效抑制了 RB 的生長，同時保留了視網膜功能，為眼后段疾病的治療提供了一種變革性的策略。相關論文以“Harnessing semen-derived exosomes for noninvasive fundus drug delivery: A paradigm for exosome-based ocular fundus therapeutics”為題，發表在Science Advances上，并被Nature作為研究亮點報道。

研究團隊首先合成了具有雙重功能的碳點（CDs）。通過一步溶劑熱法，以檸檬酸、硫脲、氯化亞鐵和硼酸為前驅體，制備出的 CDs 粒徑均一（約4.14 nm），展現出優異的近紅外熒光特性，發射峰位于621 nm，且光穩定性優于傳統成像劑，這為后續實時追蹤藥物在眼內的分布奠定了基礎。同時，通過高分辨透射電鏡、元素映射和X射線光電子能譜等表征手段，研究人員確認了 CDs 中 Fe-N?S-B/C 配位中心的原子結構，這種獨特的結構賦予了 CDs 卓越的過氧化物酶（POD）樣活性，能夠在腫瘤微環境中高效催化產生活性氧（圖2）。

圖1. FA-SEVs@CMG 在視網膜母細胞瘤治療中的作用機制示意圖。 SEVs 能夠暫時性破壞眼屏障的緊密連接，促進 CMG 向眼后段的遞送。在腫瘤微環境中，CMG 產生強烈的氧化應激，擾亂自噬-凋亡的平衡，促使自噬從細胞穩態的守護者轉變為細胞死亡的放大器，并通過激活外源性凋亡通路（BID-caspase-8）進一步促進凋亡，從而誘導視網膜母細胞瘤細胞的自我毀滅。

在確認了 CDs 的性能后，研究者從豬精液中成功提取并表征了 SEVs。透射電鏡圖像顯示了 SEVs 經典的囊泡形態，動態光散射和納米顆粒追蹤分析證實其粒徑約為120 nm，且具有良好的單分散性。Western blot 分析確認了 SEVs 表達典型的外泌體標志物（CD9、CD63、Alix），而幾乎不含有細胞器污染，證明了分離產物的高純度（圖2）。

圖2. CDs 的合成與 SEVs 的提取。 （A）CDs 合成方法的示意圖。（B）CDs 的透射電鏡和高分辨透射電鏡圖像；插圖為計算的平均粒徑（納米）。（C）透射電鏡能譜圖譜估算的元素原子含量。（D）SEVs 收集與分離流程示意圖。（E）SEVs 的透射電鏡圖像。（F）動態光散射（DLS）和（G）納米顆粒追蹤分析（NTA）測定的 SEVs 粒徑（n=3）。（H）免疫印跡分析 SEVs 及上清液+精子細胞中表達的外泌體標志物（CD9、CD63 和 Alix）、內質網標志物（鈣連蛋白）、線粒體標志物（COX IV）和細胞核標志物（組蛋白 H3）。

為驗證 SEVs 的滲透能力，研究者將 CDs 裝載入 SEVs（SEVs-CDs）并進行了體外角膜滲透實驗。Franz 擴散池結果顯示，SEVs-CDs 在10小時內的角膜累積滲透率高達14.0%，顯著優于魚精蛋白修飾的脂質體、腫瘤細胞來源外泌體以及游離 CDs。在離體角膜上皮細胞單層模型中，SEVs-CDs 的表觀滲透系數（Papp）同樣最高。更重要的是，在小鼠和兔眼組織切片中，SEVs-CDs 在滴眼后6小時迅速在視網膜-脈絡膜區域富集，而游離 CDs 幾乎未見明顯信號。這些結果直觀地證明了 SEVs 作為無創眼底遞送載體的巨大潛力（圖3，圖4A-E）。

圖3. SEVs 眼內滲透能力的研究。 （A）CDs、ProLs-CDs、SEVs-CDs 和 Y79Es-CDs 的粒徑和 zeta 電位分布。（B）以兔角膜為膜的 Franz 透皮擴散示意圖。（C）不同組別的體外兔角膜累積滲透百分比。（D）在指定時間點局部給予不同眼用制劑后，CDs 在小鼠眼組織和視網膜組織中分布的熒光共聚焦顯微鏡圖像，以及（E）圖像量化分析[4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）：藍色，CDs：紅色]。h，小時；a.u.，任意單位。（F）使用不同滴眼液后，CDs 在小鼠整個眼球中的穿透情況。數據以平均值 ± 標準差表示。圖（B）、（C）和（E）中的 P 值通過單因素方差分析（ANOVA）與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

進一步的機制研究表明，SEVs 之所以能高效滲透眼組織，關鍵在于其能夠可逆地調控細胞間的緊密連接。免疫熒光染色顯示，SEVs 處理會導致角膜上皮細胞中 ZO-1、F-肌動蛋白、閉合蛋白和E-鈣粘蛋白的表達降低，但與魚精蛋白不同的是，SEVs 處理后的緊密連接蛋白在24小時內可恢復至正常水平。跨上皮電阻（TEER）監測結果也證實，SEVs 在1小時內引起約45%的可逆性電阻下降，而魚精蛋白則導致27%的不可逆損失。這種可逆的、非破壞性的緊密連接重塑機制，使得 SEVs 在確保高效遞送的同時，也保障了眼組織屏障的長期完整性（圖4F-H）。

圖4. SEVs 眼內滲透性的體內驗證及機制研究。 （A）不同滴眼液處理后不同時間點收集的兔眼球共聚焦圖像（DAPI：藍色，CDs：紅色）。應用 SEVs-CDs 滴眼液后1小時（B）、6小時（C）、12小時（D）和24小時（E）兔眼角膜、虹膜、視網膜和脈絡膜、晶狀體、玻璃體和房水中 CDs 的分布。（F）不同處理條件下 ZO-1 分布的免疫熒光成像和定量分析。（G）不同處理組孵育后人角膜上皮細胞（HCEC）單層中（Ga）E-鈣粘蛋白和（Gb）閉合蛋白的 Western blot 分析。Western blot 條帶強度使用 ImageJ 量化，并歸一化至相應的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）水平。（H）暴露1小時及磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，在23小時內監測不同處理組 HCEC 的跨上皮電阻（TEER）。數據表示為平均值 ± 標準差。圖（F）、（Ga）、（Gb）和（H）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

通過對不同品種豬來源的 SEVs 進行定量蛋白質組學分析，研究者發現 SEVs 的EGF表達水平與眼內滲透能力呈強正相關。利用 EGF 中和抗體處理 SEVs 后，其誘導緊密連接開放和促進眼內滲透的能力顯著下降。進一步的信號通路研究證實，SEVs 通過其表面的 EGF 蛋白激活角膜上皮細胞上的表皮生長因子受體（EGFR），進而引發 Src 蛋白激酶磷酸化、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）表達上調，最終導致肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，從而可逆地開放緊密連接。使用 EGFR、Src 或 MLCK 的特異性抑制劑，均可阻斷 SEVs 的滲透增強效應（圖5，圖6）。這一系列實驗首次揭示了 SEVs 介導眼屏障通透性的關鍵分子機制，為仿生納米載體的設計提供了全新靶點。

圖5. SEVs 的蛋白質組學分析及介導眼屏障穿透蛋白的篩選。 （A）樣本相關性熱圖。（B）A至E組中 CD9、CD63 和 Alix 的表達水平。給藥后6小時，A至E組 SEVs 滲透進入小鼠（C）和兔（D）眼睛的情況。E 組與 B 組（E）以及 D 組與 C 組（F）差異表達蛋白的火山圖。（G）SEVs 中促進精子穿透生殖屏障的蛋白（如 PTGDS 和 ACRV1），以及與眼屏障緊密連接調控通路相關的蛋白的蛋白質組學篩選和定量分析。（H）蛋白表達譜與眼內滲透性指標間相關分析的熱圖可視化。

圖6. EGF 影響 SEVs 眼內滲透性的機制。 （A）通過抗 EGF 抗體抑制 SEVs 相關 EGF 的 Western blot 驗證。EGF 抗體抑制前后 SEVs 在小鼠（B）和兔（C）眼中的滲透效率。（D）EGF 抗體抑制前后 SEVs 對 HCEC 單層 TEER 的影響。（E）Western blot 分析 EGF、SEVs 或抗 EGF SEVs 處理的 HCEC 單層中 EGFR-Src-MLCK-MLC 通路的激活情況。與 EGFR/Src/MLCK 抑制劑（吉非替尼、達沙替尼和 ML-7）共處理的 HCEC 單層中，EGF（F）/SEVs（G）對 TEER 的調節作用。與 EGFR/Src/MLCK 抑制劑共處理的 HCEC 單層中，EGF（H）/SEVs（I）對 MLC 磷酸化的誘導作用。數據表示為平均值 ± 標準差。圖（B）和（C）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（P < 0.0001）。圖（D）、（F）和（G）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

在確證了 SEVs 的遞送效率后，研究團隊構建了針對 RB 的治療體系 FA-SEVs@CMG。通過將裝載有 CMG 納米酶系統的 SEVs 表面修飾葉酸，實現了對腫瘤細胞的主動靶向。透射電鏡和動態光散射等表征手段確認了該復合納米系統的成功構建，其粒徑約為142 nm，且保留了 SEVs 原有的滲透能力（圖8）。體外細胞實驗顯示，FA-SEVs@CMG 能夠通過網格蛋白介導的內吞和巨胞飲作用高效進入 Y79 視網膜母細胞瘤細胞，并定位于溶酶體酸性環境中，激活其酶活性（圖8）。

圖7. CDs 的原子結構表征。 （A）CDs 中 Fe K 邊的 XANES 譜。（B）CDs、FeS?、Fe 箔、FePc、Fe?O? 和 FeO 的 EXAFS 譜的傅里葉變換 k2 加權 χ(k) 函數。（C）CDs 和參考樣品（Fe 箔、FeS?、FeO、Fe?O? 和 FePc）的 k3 加權 EXAFS 數據的小波變換等高線圖。（D）CDs、Fe 箔、FeS?、FeO、Fe?O? 和 FePc 的 FT k2 加權 EXAFS 譜。（E）CDs 在 R 空間的相應 EXAFS 擬合曲線。插圖：CDs 表面模型。（F）CDs 在 k 空間的 EXAFS 擬合曲線。

圖8. FA-SEVs@CMG 的制備及細胞內抗癌治療。 （A）FA-SEVs@CMG 在環境光（左）和 350 nm 激光照射（右）下的外觀。（B）MnO?、CMG 和 FA-SEVs@CMG 的透射電鏡圖像。（C）不同材料的動態光散射（DLS）粒徑和（D）zeta 電位。（E）SEVs、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白分析。（F）游離 CDs、CMG、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 在 Y79 細胞中孵育 1 小時和 4 小時的共聚焦熒光成像。各組 CDs 的熒光定量結果如右圖所示。細胞核用 DAPI（藍色）染色，溶酶體用 LysoTracker Green 染色。（G）溫度和內吞抑制劑對不同組別在 Y79 細胞中細胞攝取的影響。以不同組別的非抑制內吞作用作為陽性對照。（H）通過 2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）對 Y79 細胞中活性氧（ROS）進行共聚焦熒光成像。各組 ROS 熒光強度的定量結果如右圖所示。數據以平均值 ± 標準差表示。圖（F）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（*P < 0.001，**P < 0.0001）。圖（G）和（H）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（****P < 0.0001）（n = 3）。

在抗腫瘤機制方面，FA-SEVs@CMG 展現了三重殺傷效應。進入細胞后，CMG 系統在腫瘤微環境條件下發生級聯反應：MnO? 消耗谷胱甘肽（GSH）并產生氧氣，氧氣進一步促進葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉化為過氧化氫，過氧化氫又在 CDs 的過氧化物酶活性催化下生成大量羥基自由基（·OH），引發劇烈的氧化應激。這種氧化應激不僅誘導了鐵死亡（表現為脂質過氧化物累積和 GPX4 下調），還導致線粒體膜電位崩潰，激活了內在凋亡通路（caspase-9/-3/-7 活化）。更重要的是，過度的氧化應激將自噬從保護機制轉變為促死信號：自噬不僅無法挽救細胞，反而通過激活 BID-caspase-8 軸啟動了外源性凋亡通路，形成惡性循環，最終導致腫瘤細胞自我毀滅（圖9）。通過使用自噬抑制劑 3-MA 和活性氧清除劑 NAC，研究者進一步證實了這種應激強度依賴性的自噬-凋亡轉換機制。

圖9. FA-SEVs@CMG 的抗癌機制研究。 （A）不同處理組 Y79 細胞中 LC3/II、GPX4 和 Caspase-9 蛋白的 Western blot 結果。（B）有無 3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理時，Y79 細胞中 Caspase-3 和（C）Caspase-7 蛋白活性。（D）不同處理組 Annexin V/PI 染色的 Y79 細胞流式細胞術結果。（E）3-MA 處理下，不同處理組 Annexin V/PI 染色的 Y79 細胞流式細胞術結果。（F）有無 3-MA 處理時，不同處理組 Y79 細胞流式細胞術 Annexin V/PI 染色的定量結果。有無 3-MA 處理時，不同處理組 Y79 細胞中 Caspase-9、Bcl-2、Caspase-9 和 BID 蛋白的 Western blot 結果（G）無 3-MA，（H）有 3-MA。數據表示為平均值 ± 標準差。圖（B）、（C）和（F）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（*P < 0.05 和 **P < 0.0001）（n = 3）。

在動物實驗中，研究團隊建立了原位 RB 小鼠模型。結果顯示，FA-SEVs@CMG 滴眼液治療組的小鼠眼內生物發光信號顯著減弱，腫瘤面積僅相當于對照組的2.35%，而游離 CDs 組和 CMG 組的腫瘤負擔依然很高。組織切片染色進一步證實了 FA-SEVs@CMG 的卓越抗腫瘤效果，同時，視網膜電圖（ERG）檢測顯示，接受 FA-SEVs@CMG 治療的小鼠保留了近乎正常的視網膜功能（圖10）。熒光成像結果還顯示，FA-SEVs@CMG 能夠實時監測腫瘤大小，體現了其診療一體化的潛力。在安全性評估方面，研究者對 SEVs 來源進行了嚴格的病毒檢測，證實其安全性。長期給藥后的組織病理學檢查、眼壓監測和免疫反應分析均未發現明顯的毒副作用或眼內免疫激活，證實了該制劑具有良好的生物相容性（圖10）。

圖10. FA-SEVs@CMG 在 RB 小鼠體內的藥效學研究。 （A）建立 RB 模型及動物實驗設計的示意圖。（B）30天內不同處理后 Y79 RB 小鼠的代表性體內生物發光圖像及平均生物發光信號定量結果（Ba）。（C）不同處理30天后，小鼠眼睛的代表性圖像和（D）蘇木精-伊紅（H&E）染色切片。（Da）圖（D）中腫瘤面積的定量結果。（E）不同處理后 RB 小鼠在暗適應條件下的代表性視網膜電圖（ERG）波形響應。虛線表示陽性對照組的 a 波和 b 波值。（F）不同處理后 RB 組織中 P62、TUNEL 和 Ki-67 的代表性免疫熒光結果。數據表示為平均值 ± 標準差。圖（Ba）和（Da）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（n = 3）（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）。

總而言之，這項研究首次建立了基于精液來源外泌體的無創眼后段遞送平臺，成功解決了外泌體藥物在眼部無創遞送領域的核心瓶頸。通過揭示 SEVs 依賴 EGF-EGFR 信號軸可逆調控緊密連接的機制，研究不僅為眼底病治療提供了新的載體選擇，更為開發仿生納米載體指明了方向。FA-SEVs@CMG 滴眼液集高效穿透、主動靶向、多重殺傷和實時監測于一體，在視網膜母細胞瘤模型中取得了顯著的治療效果，同時保留了寶貴的視力。這一突破性成果不僅為視網膜母細胞瘤的患兒帶來了新的希望，也為年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等其他眼后段疾病的治療提供了具有廣闊應用前景的通用策略。盡管臨床轉化仍面臨規模化生產、標準化和免疫原性等挑戰，但該研究無疑為眼后段疾病的治療范式帶來了深刻的變革。