基于放射性標記的ADC藥物ADME研究

抗體藥物偶聯物（ADC）是一類用于癌癥靶向治療的生物藥物，由單克隆抗體與一種或多種生物活性載荷連接而成。迄今為止，FDA和EMA已經批準了13種不同的抗體藥物偶聯物用于多種腫瘤學適應癥的治療，這些ADC包括不同的連接子、細胞毒性載荷和偶聯技術。本文圍繞ADC類藥物的放射性標記ADME相關內容展開討論。

吸收、分布、代謝和排泄研究

使用放射性標記藥物進行的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）和排泄（Excretion，ADME）研究在藥物開發中發揮著關鍵作用。吸收研究可以確定新藥物如何進入人體并被吸收到血液中；分布研究則考察藥物如何從吸收部位轉移到體內的不同組織；代謝研究確定藥物代謝產物的形成、藥物代謝的速度，以及形成的代謝產物是否具有潛在的活性或毒性。最后，排泄研究關注藥物如何從體內被清除以及清除的速度。總體而言，這些研究為篩選藥物候選物、優化給藥方案以及在監管審查中解釋安全性和有效性數據提供了關鍵信息。

對于單抗，通常不會進行放射性標記的分布、代謝和排泄研究，因為單抗被分解為天然氨基酸，這些氨基酸通常不存在安全性問題。然而，對于ADC，情況則有所不同。ADC通常通過靜脈給藥，吸收通常不是問題。分布方面，小分子藥物與大分子（如抗體）結合后的ADC，藥物的分布由抗體成分決定，抗體作為小分子的載體。當ADC與腫瘤細胞表面的靶點結合并被內吞后，細胞毒性載荷從ADC中釋放出來殺死細胞。此外，ADC也可能通過內吞作用被不表達目標靶點的細胞攝取。區分ADC藥物的降解和代謝有一定難度，故統稱為“生物轉化”。

不同的偶聯技術和連接子/載荷化學性質會顯著影響ADC的生物轉化。一般來說，細胞毒性載荷及其生物轉化產物在ADC在體內某個部位（如靶向的腫瘤或正常組織）被細胞內降解后釋放到循環中。釋放的載荷及其生物轉化產物隨后可以到達多種組織中，并進一步被代謝或被清除。如果釋放的生物轉化產物具有良好的細胞通透性，可以在鄰近組織中發揮藥理作用，稱之為旁觀者效應，這種效應可能是積極的或消極的，取決于鄰近組織是腫瘤細胞還是正常細胞。此外，一旦產生載荷及其生物轉化產物，它們將受到與傳統小分子相同的藥物代謝酶和轉運蛋白的作用。

為了理解ADC的暴露與安全性之間的關系，必須了解完整ADC在組織中的分布、生物轉化機制（不僅包括結合藥物，還包括其釋放的生物轉化產物，如載荷），以及這些產物的最終排泄情況。由于細胞毒性載荷或其生物轉化產物在組織中的積累可能會影響ADC的療效和安全性，因此其組織滯留是放射性標記分布研究中需要重點關注的指標。此外，與所有生物治療藥物一樣，ADC也可能引發抗藥物免疫反應。免疫反應可能針對ADC的抗體部分、細胞毒性載荷、偶聯產生的新表位，或三者的組合。這些免疫反應可能會改變ADC的分布、代謝和排泄特性。因此需要仔細進行免疫原性評估，以了解其對安全性和療效的影響。

用于分布、代謝和排泄研究的技術

放射性標記是開展藥物分布、代謝和排泄研究的關鍵技術。放射性標記可以針對ADC的抗體、載荷，或兩者同時進行，通常用于評估藥物偶聯對抗體分布的影響，或探索細胞毒性載荷的分布情況。

傳統的蛋白質標記方法通常使用γ放射性同位素125I或β、γ放射性同位素131I。使用γ放射性碘同位素需要特殊的設備和實驗室設施來確保放射安全。另外需要注意的一點是，蛋白質的放射性碘化存在一個主要問題是體內脫鹵作用，這種作用由脫碘酶引起，可能導致甲狀腺對放射性碘的攝取增加。

89Zr是一種可用于正電子發射斷層掃描（PET）研究的放射性同位素，用于在體內可視化ADC的分布。89Zr的半衰期較長，約3.27天，可以充分評估ADC在靶組織中的分布。此外，還有其他多種金屬被用于抗體標記，如111In、177Lu、64Cu和225Ac。然而，使用放射性金屬標記蛋白質需要使用螯合連接子，金屬與連接子結合可能會改變抗體的物理化學性質，從而導致ADC的分布特性發生改變。

在動物和人體的分布、代謝和排泄研究中，β放射性同位素3H或14C通常是首選。14C通常被認為是小分子藥物的首選同位素，因為它在體內因代謝而丟失的可能性較低。當然，3H的比活度比14C高得多，這對于標記像ADC這樣分子量約為150 kDa的大分子具有優勢。對于ADCs，通常將載荷部分用14C或3H標記，以便追蹤釋放的經生物轉化后的生物活性物質（BPs）。

作為放射性標記的替代方法，治療性蛋白還可以用近紅外（NIR）或熒光染料進行標記。NIR標記成本較低，且不需要特殊設備或放射性安全防護。然而，抗體與染料的結合可能會改變蛋白質的物理化學性質。根據標記程度的不同，熒光團結合可能會對抗體的血漿清除和組織分布產生影響。

僅在抗體或載荷上使用一種放射性核素進行分布研究的一個缺點是，無法同時追蹤抗體和載荷的分布。可以采用互補方法，如采用雙重放射性標記方法（一個放射性標記在抗體上，另一個放射性標記在載荷上），以區分不同分析物的分布模式。

分布研究

已上市ADC產品的組織分布研究

FDA和EMA已批準了至少13種ADC上市。其中，12種ADC的蛋白部分由單抗通過連接子與細胞毒性載荷連接而成。大部分ADC（11/13），連接子可通過酶解或pH依賴性斷裂。使用的細胞毒性載荷種類豐富，包括卡利奇霉素、DM1、DM4、PE38、SN38、Dxd、PBD、MMAF和MMAE。

已獲批的ADC中，6款ADC（gemtuzumab ozagamizin, trastuzumab emtansine, inotuzumab ozagamicin, polatuzumab vedotin, belantabmab mafodotin, mirvetuximab soraytansine）在大鼠中進行了組織分布研究。對于trastuzumab deruxtecan，組織分布評估在食蟹猴中進行。另有3款ADC(sacituzumab govitecan, tisotumab vedotin, trastuzumab deruxtecan)，組織分布評估在荷瘤小鼠中進行，因為使用荷瘤動物有助于展示腫瘤靶向性，且腫瘤可能會影響整體組織分布。有4款ADC(brenituxmab vedotin, moxetumomab pasudotox, enfortubmab vedotin, loncastuximab tesirine)，未進行組織分布研究。此外，有6款ADC組織分布采用了標記細胞毒性載荷的方式完成。需要注意的是，大鼠或小鼠的組織分布結果應謹慎解讀，因為嚙齒動物可能并非ADC的藥理學相關動物種屬，可能無法評估靶點介導的組織分布。

為了進行ADC的組織分布分析，ADC的單克隆抗體部分通常用125I、3H、14C、111In或89Zr標記，而細胞毒性載荷通常用3H或14C標記。將放射性標記連接到抗體上可以追蹤ADC中的單抗成分在體內的分布，而標記到載荷上則可以追蹤ADC的生物活性部分。

可以采用不同的方法評估放射性標記ADC或標記載荷的組織分布，例如通過組織解剖后進行燃燒和液體閃爍計數（LSC），或通過定量全身放射自顯影（QWBA）進行組織分布分析。血液和組織評估通常在單次靜脈給藥后持續長達14天。

未對ADC進行組織分布研究的可能原因之一是，單劑量PK研究中的表觀分布容積（Vss）表明，完整ADC的組織分布有限。一般來說，ADC組織與血漿的AUC比值小于1，與ADC的較小Vss一致，表明ADC主要分布在血漿中。在給藥后數小時內，通常在高血流灌注的組織中檢測到放射性，隨后隨著時間推移逐漸減少，在組織中未觀察到明顯的持續存在。從已有數據看，ADC通常無明顯的器官蓄積。相比之下，放射性標記的游離細胞毒性載荷的組織分布快速且廣泛，Vss較高，組織與血漿的AUC比值大于1，表明游離載荷的組織分布廣泛。

QWBA用于ADC分布研究的考慮

QWBA是一種廣泛應用于放射性標記化合物及其代謝物組織分布研究的成像技術。在動物分布研究中，QWBA數據通常用于估算人體ADME研究中放射性吸收劑量，從而評估放射性劑量的安全性。

盡管QWBA技術應用廣泛，但也存在一些局限性。首先，其分辨率限制了在嚙齒類動物等臨床前種屬中的組織分布分析，僅能到達組織/器官水平，無法進行細胞水平的評估，因此無法完成原位受體結合的評估。其次，在放射性標記的ADC的組織分布分析中，無法區分完整ADC、游離載荷或生物活性部分，因此估算的組織PK參數可能反映的是多種放射性標記成分的混合分布。此外，如前文所言，ADC抗體部分通常不與嚙齒動物靶點結合，可能導致分布特征的變化。此外，由于擔心灌注會影響實際組織分布，通常不在分析前對動物進行灌注以去除血液殘留，因此無法完全排除組織中血液污染的可能性。

盡管存在這些局限性，QWBA數據仍為非靶點介導的器官和組織暴露提供了良好的評估基礎，有助于了解放射性標記ADC及標記生物活性部分在器官和組織中的滯留情況。盡管根據ICH S9指南，對于抗腫瘤藥物，如果嚙齒動物與人體的分布存在差異，則不需要進行ADC的組織分布研究，但QWBA分布數據仍可能為潛在的毒理學和藥理學作用位點提供線索。此外，使用荷瘤動物進行組織分布分析可以幫助更好地理解特定ADC的腫瘤靶向特性及其在腫瘤組織中的選擇性蓄積能力。

其它成像技術

除了經典的通過QWBA或LSC這些傳統組織分布分析方法外，還可以利用單光子發射計算機斷層掃描（SPECT）/CT進行分子成像，以非侵入性方式實時獲取放射性標記ADC在體內的組織分布定量圖像。可以實現多次對同一動物進行成像，追蹤標記有γ射線放射性同位素（如125I）的抗體的組織分布，從而減少實驗動物的使用數量。然而，僅追蹤抗體作為遞送載體無法確定細胞毒性載荷在體內是否保留或丟失，也無法確定遞送載體在所用生物系統中是否保持完整。因此，對載荷和抗體進行雙重放射性標記可能有助于評估ADC在體內的穩定性。需要注意的是，與QWBA全身分布分析相比，SPECT/CT的空間分辨率有限。

此外，如前文所述，QWBA僅顯示總放射性標記成分的分布，無法確定組織中觀察到的放射性是否來自完整ADC、釋放的載荷或BPs。為了確定腫瘤組織中的主要BP成分，可以應用液體萃取表面分析微液相色譜-串聯質譜（LE SA-μLCLC-MS/MS）技術，鑒定具體結構。

除了先進技術，為了區分ADC和游離載荷分布的不同，雙重放射性標記也是一種選擇。比如抗體部分標記3H，載荷部分標記14C。或者載荷部分標記131I，抗體部分標記89Zr。比如Cohen等人使用一種雙重放射性標記的ADC，載荷部分標記131I，抗體部分標記89Zr，用于研究賴氨酸連接的tubolysine抗體的分布。這種同位素組合可以使兩種同位素的分布曲線在沒有干擾的情況下進行檢測。結果顯示，在結腸和回腸內容物中131I水平高于89Zr，很可能是由于游離載荷的存在。此外，在腫瘤組織中89Zr的攝取高于131I，這可能是因為131I在ADC內化后從腫瘤中釋放，而89Zr殘留在細胞內。

代謝和排泄研究

小分子化合物通常會開展代謝研究，生物藥則往往不需要。ADC本質上是由小分子連接到單抗上構成的，因此代謝研究主要集中在識別從抗體上釋放的小分子生物轉化產物，開展類似小分子的 ADME 研究，這些研究是針對釋放的有效載荷進行的，例如體外跨種屬代謝物識別、血漿蛋白結合和血液分布，以及用于支持 DDI 評估的體外研究。當然，很多試驗并未使用放射性標記技術開展，不在本文討論之列。

已上市ADC開展的代謝和排泄研究

在13種獲批的ADC中，有9種進行了放射性標記的生物轉化研究。未進行放射性標記生物轉化研究的4種ADC分別是moxetumomab pasudotox、sacituzumab govitecan、loncastuximab tesirine和tisotumab vedotin。

對于loncastuximab tesirine，其使用的載荷是SN38，這是一種由1996年獲批的前藥伊立替康產生的小分子化合物，當時曾進行過放射性標記的ADME研究。對于tisotumab vedotin，申請人引用了含相同載荷（MMAE）的其他ADC brentuximab vedotin的既往注冊信息。換句話說，這倆ADC用的不是新載荷，已有過充分的研究。

在進行放射性標記生物轉化研究的9種ADC中，有6種既進行了放射性標記ADC的研究，也進行了放射性標記載荷的研究。Mirvetuximab soravtansine僅進行了用氚標記的ADC的體內大鼠研究，未進行放射性標記載荷的研究。可能是因為ADC上的放射性標記位于載荷上，從而能夠追蹤和識別釋放的生物轉化產物。Mnfortumab vedotin和belantamab mafodotin這兩款ADC僅進行了放射性標記載荷的生物轉化研究，而未對ADC本身進行放射性標記。對于enfortumab vedotin，與之前討論的tisotumab vedotin類似，其MMAE載荷通過纈氨酸-瓜氨酸可切割連接子與抗體相連，而這種連接子也曾用于其他兩種獲批的ADC（polatuzumab vedotin和brentuximab vedotin），且在這兩種ADC的生物轉化研究中，對ADC進行了放射性標記。故enfortumab vedotin僅開展了放射性標記載荷的研究。

在9種報告了放射性標記生物轉化研究的ADC中，有6種同時開展了放射性標記的體內和體外研究。3種ADC（polatuzumab vedotin、trastuzumab deruxtecan和mirvetuximab soravtansine）僅開展了放射性標記體內研究。當然，這并不意味著沒有使用非放射性標記的ADC或載荷進行體外研究。實際上，很可能進行了這類研究，因為許多這類研究并不需要使用放射性標記。同樣，在體內研究中，也并非所有的生物轉化研究都需要使用放射性標記。例如，brentuximab vedotin和inotuzumab ozogamicin的人體研究中，就對非放射性標記的生物轉化產物進行了定量和/或鑒定。

開展ADC人體放射性標記研究的挑戰

盡管FDA最近發布了關于在人體中進行放射性標記物質平衡研究的草案指南，但該指南僅適用于新的化學實體（NCE），而不適用于需要提交生物制品許可申請（BLA）的ADC。有趣的是，該指南提到，對于單克隆抗體、內源性物質及其類似物（例如肽、激素、寡核苷酸治療藥物）等已知代謝和排泄途徑的藥物，基于基礎藥理學和非臨床ADME信息，不推薦進行人體物質平衡研究。因此，該指南部分內容可能也適用于ADC的抗體部分，但不適用于連接子-載荷部分。

總體而言，專門針對ADC開發的監管指南較少。然而，FDA最近發布了一份關于ADC臨床藥理學考慮的指南，其中建議對ADC及其釋放的載荷進行ADME評估，以評估是否需要在特殊人群中進行臨床藥理學研究，但并未推薦進行動物或人體的放射性標記物質平衡研究。

中國CDE發布了《抗體偶聯藥物非臨床研究技術指導原則》。該指南建議，當ADC釋放的小分子生物轉化產物（BPs）是新分子（即之前未在人類中進行臨床試驗）且ADC靶向非典型器官（如大腦，即非腫瘤學適應癥）時，應進行放射性標記的ADME研究。此外，如果BPs是新的載荷，建議根據ICH M3或ICH S9指南進行非臨床研究，以確定這些BPs是否在人體中過度形成。

據查，目前獲批的ADC基本沒有在人體中開展放射性標記物質平衡研究的先例。在所有獲批的ADC中，僅brentuximab vedotin進行了一項排泄研究，在癌癥患者中對原型藥在血漿和排泄物中的含量進行了定量分析。在為期一周的收集期間，僅回收了23.5%的母體化合物。

在之前的一份白皮書中，不推薦在人體中進行物質平衡研究，至少對于晚期癌癥患者是這樣的。由于ADC在腫瘤學中通常使用的細胞毒性藥物作為載荷，因此在健康志愿者中給予這類產品并不合適，此類評估必須在癌癥患者中進行。ADC的半衰期可能在幾天到幾周之間，這使得設計一項能夠收集足夠排泄物的研究非常具有挑戰性，并且在腫瘤患者中進行此類研究可能并不符合倫理。而較短時間的ADME研究可能導致獲取的物料平衡數據不完整。此外，由于這些生物轉化產物的濃度通常非常低，識別含有載荷的外周生物轉化產物可能具有挑戰性。

根據ICH S9，對于包括ADC在內的腫瘤產品，通常不需要對人體代謝物及其在毒性測試種屬中的覆蓋情況進行調查。然而，對于那些用于非腫瘤學領域的慢性非致命疾病的ADC（不受ICH S9指南的覆蓋），可能需要對人體和動物血漿中的ADC及其生物轉化產物進行準確定量。

藥物的ADME研究通常在人體中使用14C放射性標記藥物進行，放射性劑量高達約100 μCi。一般通過標準放射性檢測技術（如液體閃爍計數法）來確定物質平衡以及血漿和排泄物中的放射性情況。對于在組織和血漿中半衰期較長且劑量較低的藥物，標準的人體ADME研究設計并不適用，因為為了確定血漿和組織的半衰期以及血漿和排泄物中的代謝物譜，人體需要暴露于較高劑量的放射性。

為了解決這一問題，開發了所謂的微量示蹤劑方法，將低至0.1-1μCi的放射性劑量給予健康志愿者或患者。在這種低劑量下，放射性體內負荷極低，因此無需進行上述用于支持劑量設計的臨床前QWBA研究。為了滿足此類微量示蹤研究中對14C放射性檢測靈敏度增加的需求，加速器質譜（AMS）技術就派上了用場。AMS技術過去主要用于具有長藥代動力學消除半衰期或高黑色素和組織結合的小分子，或者在放射性安全方面因14C放射性暴露而存在問題的藥物。然而，AMS技術也已應用于生物制品。

首次將AMS應用于生物制品的藥物研究是用于評估14C標記重組蛋白在大鼠中的藥代動力學。此外，一個行業小組進行了一項比較生物分析研究，使用三種分析平臺（AMS、LC-MS/MS和LSC）評估豚鼠中三種治療蛋白的胚胎暴露。LSC和LC-MS/MS均未能提供胎盤轉移的可報告結果，而AMS能夠以fg/mL的靈敏度，僅使用10 μL樣本，提供豚鼠中PEG-Adnectin和PETET-dAb的轉移比結果，低至0.2%。

荷蘭應用科學研究組織（TNO）的一個小組在2015年首次證明，通過在少量健康受試者中使用微劑量，可以成功獲得人體中新型生物制品的藥代動力學數據。在僅進行有限的臨床前測試后，進行了一項首次人體0期/1期試驗，以評估重組人胎盤堿性磷酸酶（hRESCAP）的安全性和藥代動力學。藥代動力學分析顯示，從微劑量（53 μg14C -hRESCAP）到治療劑量（5.3 mg14C -hRESCAP），該蛋白在健康志愿者中的暴露量呈線性關系。然而，對于蛋白質（包括ADC）的分布、代謝和排泄研究而言，人類微劑量研究并非最佳方法。微劑量下的靶點介導藥物處置可能會影響ADC的清除率和暴露量，從而導致與較高治療劑量不同的藥代動力學。

AMS技術的發展使得實驗室規模更小、更緊湊的儀器得以實現，并通過氣態CO?自動進樣。盡管AMS已證明其獨特性能，并減少了空間需求以便在常規實驗室中使用，但其安裝和維護仍然并非易事。原則上，基于激光光譜學的光學檢測方法可以以更簡單、更經濟的配置實現與AMS競爭的結果。該領域的最新應用是腔環衰蕩光譜（CRDS）。CRDS已用于分析14C標記的metelimumab在大鼠中的情況，并獲得了與AMS相似的檢測限。

AMS和CRDS似乎都是測量臨床研究中14C微量的有前景的技術。值得強調的是，這些放射性檢測技術的進步可能有助于檢測循環中ADC的代謝產物。目前，ADC及其BPs的結構鑒定主要通過高分辨率質譜完成，但由于它們在循環中的濃度通常較低，成為一個挑戰。然而，下一代質譜儀器不斷改進的檢測限以及上述額外技術可能有助于在未來填補這一空白。

最后，附上已獲批ADC產品開展的非臨床分布、代謝和排泄研究匯總表。