寡核苷酸類藥物的1-4類雜質及其限度介紹

寡核苷酸的生產通常采用成熟的亞磷酰胺法，通過自動化的固相樹脂化學合成實現，所使用的起始原料源自受保護的2'-脫氧核苷（dA、dC、dG、T）、核糖核苷（A、C、G、U）或化學修飾核苷。寡核苷酸原料藥中的雜質來源包括三方面：1）原材料；2）合成過程；3）加工與儲存期間的降解。原材料可進一步分為起始物料（如亞磷酰胺、載堿基載體）和其他原材料（如輔助試劑）。水分控制至關重要，因為水分會與亞磷酰胺反應使其失活。按對最終藥品的影響，亞磷酰胺雜質可分為三類：1）非反應性且非關鍵雜質；2）反應性但非關鍵雜質；3）反應性且關鍵雜質。此處僅討論第三類雜質（反應性且關鍵），因其最終會成為原料藥中的雜質。在多數情況下，這些雜質屬于非天然物質，因此被寡核苷酸安全工作組（OSWG）2017年白皮書歸為IV類雜質。

法規申報中需說明雜質及其產生機制。盡管在初始IND（investigational new drug，新藥研究申請）/CTA（clinical trial application，臨床試驗申請）提交中，這部分內容較為簡略，但隨著研究藥物進入臨床開發階段，需更深入地闡明雜質及其來源，并與監管機構溝通。

為獲得目標寡核苷酸序列，按序列順序在固相樹脂上依次偶聯，從序列的3'端起始，逐步延伸至5'端。自20世紀80年代初以來，該合成過程已實現全自動化。鏈組裝完成后，通過從固相載體上切割產物、全局脫保護，再經高效液相色譜（HPLC）、超濾和凍干等下游處理實現分離。在每個工藝步驟中，反應不完全或副反應可能導致終產物中產生雜質。不同的生產工藝會產生不同的雜質，因此所采用的生產工藝直接影響雜質譜，需對雜質進行識別、定量，并通過設定質量標準加以充分控制。本文結合2017年寡核苷酸安全工作組（OSWG）白皮書所述指南，對常見雜質進行分類。

2017年OSWG將寡核苷酸藥物中的雜質分為四大類。I–III類為非關鍵雜質，包括代謝產物、母藥序列變體或天然存在的核酸結構修飾，無需在毒理學研究中額外評估。IV類為關鍵雜質，因其非天然來源，需評估毒理特性；生產工藝應最大限度減少IV類雜質的生成。

ICH Q11（EMA，2012）指出，雜質作為原料藥的關鍵質量屬性（CQA），可能影響藥品安全性。寡核苷酸雖被排除在ICH Q6A、Q3A（有機雜質）、Q3C（殘留溶劑）之外，但需遵循其原則制定CMC控制策略。

OSWG 2017年白皮書借鑒ICH Q3A的精神，提出了寡核苷酸雜質鑒定的決策樹，并建議了單個雜質的報告、識別和鑒定閾值雜質限度（見下表）。OSWG發布的另外兩份白皮書也具有重要參考價值：一份探討安全藥理學評估（Berman等人，2014）；另一份圍繞生殖與發育毒性評估，為閾值和限度的設定提供了詳細依據（Cavagnaro等人，2014）。這些文件均應在制定寡核苷酸治療藥物的CMC控制策略時予以考慮。

高分辨離子對反相LC-MS是原料藥相關雜質CMC控制的核心工具：既可鑒定/定量雜質，又可追溯到“工藝步驟”或“起始物料”以確定雜質來源。為工藝開發提供必要信息，以避免或最大限度降低終產品中的雜質水平。下游加工中，多數雜質可通過柱色譜去除，但亞磷酰胺起始材料中的雜質因與主產物洗脫位置接近，極難（甚至無法）純化去除。此外，這類雜質會隨亞磷酰胺在整個序列中的每次摻入而累積，可能達到臨界水平。例如：若亞磷酰胺砌塊中含0.05%的關鍵活性雜質，在20mer寡核苷酸中摻入5次后，粗品中雜質水平可達0.25%；若起始材料中該雜質為0.25%，5次摻入后粗品中雜質可升至1.25%。

起始材料的質量穩定性至關重要，需在供應商或制造商層面嚴格控制。歐洲制藥寡核苷酸聯盟（EPOC）（Kiesman等人，2021）已發布相關指南。

雜質的具體分類

Ⅰ類雜質：工藝相關雜質，同時也是母體分子的主要代謝物。因與主要代謝物結構一致，默認已完成毒理學研究。

示例：3'或5'端核苷酸的內切核酸酶降解（n-1）、綴合物或連接子的丟失、尿苷通過脫嘧啶的部分/完全降解（下圖所示）、脫嘌呤導致的無堿基位點、2'F基團的消除等。

Ⅱ類雜質：工藝相關雜質，含核酸中天然存在的結構單元，但屬于修飾后的母體化合物。因結構為內源性，通常無安全性擔憂。

示例：硫代磷酸酯寡核苷酸中的磷酸二酯雜質、氧化堿基（下圖所示）、堿基轉換、3'端通過環磷酸酯形成的截短、RNA中5'-2'核苷酸鍵的形成、來自起始材料且天然存在的雜質等。

Ⅲ類雜質：工藝相關雜質，與母體分子的差異僅在于分子序列，不含新結構單元。潛在毒性可能僅限于序列改變導致的脫靶反義效應或免疫刺激（如核苷酸缺失（n-1）、插入（n+1）或替換（如脫氨））。在治療性反義策略中，這類修飾序列的水平通常過低，難以產生藥理效應。

示例：內部缺失（n-1、n-x）、內部插入（n+1、n+x）、胞嘧啶脫氨為尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶脫氨為胸腺嘧啶（下圖所示）等。

Ⅳ類雜質：工藝相關雜質，含母體分子及天然核酸中均不存在的結構單元。若其規格限度超過設定的鑒定閾值，需在非臨床毒理學研究中評估安全性。

示例：非天然堿基修飾、骨架修飾部分（如起始材料相關修飾，下圖所示）、CNET（T堿基與C6-氨基連接子的丙烯腈加合物）、工藝相關雜質、Uny linker相關雜質等。所有未知或無法識別的雜質也歸為Ⅳ類。

寡核苷酸雜質來源廣泛，有些雜質來自核糖和骨架結構，有些則來自堿基。其中，以核糖和骨架結構為例，相關雜質如下表所示。

以堿基為例，相關雜質如下表所示。

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