PNAS | 清華大學丁強/北京大學王麟合作發現肝炎E病毒復制的關鍵宿主因子

肝炎E病毒（HEV）是全球急性病毒性肝炎的主要病原體之一，每年約發生2000萬例感染。盡管我國已有一款疫苗上市，但目前尚無針對HEV的特效抗病毒藥物獲批。HEV基因組編碼的ORF1蛋白被認為是病毒復制酶復合物的核心組成部分，然而ORF1究竟是以完整前體形式發揮功能，還是需要經過蛋白酶加工產生功能性亞單位，一直是該領域懸而未決的關鍵科學問題。此外，病毒復制所依賴的宿主因子也尚未被充分闡明。

近日，清華大學丁強研究員團隊、北京大學王麟研究員團隊以及克利夫蘭診所的吳顯芳研究員團隊在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上聯合發表了題為《EIF4H and YBX1 are essential host factors for hepatitis E virus replication and pathogenesis》的研究論文。該研究通過全基因組CRISPR/Cas9敲除篩選，首次揭示了EIF4H和YBX1是HEV復制與致病所必需的關鍵宿主因子。

研究團隊首先構建了基于HEV基因3型Kernow C1/p6株的復制子系統，將ORF2和ORF3編碼區替換為報告基因zsGreen。在HEK293T細胞中進行全基因組CRISPR/Cas9敲除篩選后，通過MAGeCK算法分析發現，EIF4H和YBX1基因的敲除顯著抑制了HEV復制。進一步使用兩個獨立sgRNA驗證，證實這兩個因子對病毒復制具有關鍵調控作用。

在HepG2/C3A肝癌細胞系中敲除EIF4H或YBX1，顯著抑制了HEV基因1型、3型和4型復制子的復制水平，該表型可通過外源回補相應基因得到恢復。RT-qPCR檢測進一步證實病毒RNA水平顯著下降。值得注意的是，敲除EIF4H對HEV復制的影響遠大于敲除其經典翻譯輔助因子EIF4A1，提示EIF4H在HEV復制中發揮非經典功能。

在病毒感染實驗中，將體外轉錄的HEV基因組RNA轉染至EIF4H或YBX1敲除的S10-3細胞后，EIF4H敲除完全阻斷了子代病毒的產生，YBX1敲除使病毒產量降低約15倍。在HepG2/C3A細胞中感染HEV病毒粒子后，兩種基因敲除細胞中ORF2陽性細胞比例均顯著降低，免疫熒光染色結果與之一致。EIF4H或YBX1敲除對寨卡病毒、水皰性口炎病毒和SARS-CoV-2感染無顯著影響，證實其對HEV具有特異性。

在人誘導多能干細胞來源的肝細胞樣細胞（HLCs）中，EIF4H敲除不影響肝細胞分化標志物表達及代謝功能，但兩個獨立的EIF4H敲除克隆在HEV感染后病毒RNA水平均顯著低于野生型對照。EIF4H敲除對乙肝病毒和丙肝病毒在HLCs中的感染無顯著影響，進一步證實了其對HEV的特異性。

通過轉染含NanoLuc報告基因的HEV復制子RNA，在EIF4H或YBX1敲除細胞中監測翻譯水平，結果顯示兩種基因敲除均不影響ORF1蛋白的翻譯效率。免疫共沉淀實驗發現，EIF4H與ORF1存在特異性相互作用，該相互作用不依賴于RNA，且EIF4H通過ORF1的甲基轉移酶-Y結構域-木瓜蛋白酶樣蛋白酶區域與之結合。

利用TurboID鄰近標記技術結合質譜分析，在野生型和EIF4H敲除細胞中鑒定ORF1相關蛋白復合物的組成變化。結果顯示，EIF4H敲除導致ORF1相關蛋白復合物的組成發生顯著改變。從野生型細胞特異性富集的蛋白中篩選20個進行CRISPR驗證，發現IPO5、IPO7、NUP98等核轉運相關蛋白敲除后HEV復制水平顯著下降。

在HEK293T細胞中表達HA標簽或Flag標簽的ORF1蛋白，免疫印跡檢測顯示野生型和EIF4H敲除細胞中ORF1呈現多個大小分別為~190 kDa、~115 kDa、~75 kDa和~10 kDa的片段，表明ORF1存在特異性加工產物。而在YBX1敲除細胞中，全長ORF1是主要存在形式，~75 kDa和~10 kDa片段完全缺失，~115 kDa片段也極其微弱，提示YBX1對ORF1的加工過程至關重要。

最后，研究團隊構建了全身性Eif4h基因敲除大鼠和肝臟特異性Ybx1基因敲除大鼠。接種大鼠HEV-C1毒株后，野生型大鼠糞便中病毒RNA在感染后4-7天達到約10^7 copies/g，而Eif4h敲除大鼠在任何時間點均未檢測到病毒RNA。Ybx1肝臟特異性敲除大鼠糞便病毒RNA峰值較對照組降低約1000倍。肝臟組織中，野生型和Ybx1 fl/fl大鼠病毒載量維持在10^7-10^8 copies/g，而Eif4h敲除大鼠肝臟未檢測到病毒RNA，Ybx1肝臟特異性敲除大鼠病毒載量降低50-100倍。免疫組化染色顯示，Eif4h敲除和Ybx1肝臟特異性敲除大鼠肝臟中均未檢測到ORF2抗原陽性信號，肝組織病理學檢查也未發現炎性病變。

該研究由基礎醫學院傳染病中心丁強課題組牽頭，聯合北京大學基礎醫學院王麟（共同通訊作者）、美國克利夫蘭醫學中心吳顯芳（共同通訊作者）、清華大學藥學院秦為以及普林斯頓大學Alexander Ploss教授等團隊共同完成，充分體現了在病毒學、蛋白質組學、干細胞模型和動物模型等方面的優勢互補。清華大學鞠曉輝（博士后，已出站）、董麟（博士生，已畢業）以及北京大學劉天旭和克利夫蘭醫學中心張璠為共同第一作者。該研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金和清華大學篤實計劃的支持。

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