Nat Immunol?|?“雙面人生”——揭示TOX的CD4+ T細胞譜系特異性功能

撰文 |咸姐

T細胞的分化與功能受轉(zhuǎn)錄因子的精密調(diào)控，其命運取決于抗原遭遇的性質(zhì)和微環(huán)境信號。具體而言，初始CD8+ T細胞在急性感染等免疫激活條件下，可分化為具有細胞毒功能的效應(yīng)細胞并形成長壽命記憶細胞；而在腫瘤或慢性感染等持續(xù)性抗原刺激下，則會進入一種低反應(yīng)性的"耗竭"狀態(tài)。相比之下，CD4+ T細胞的分化更為多樣，在不同細胞因子環(huán)境的驅(qū)動下，初始CD4+ T細胞可極化為多種輔助T細胞亞群，包括TH1、TH2、TH17、濾泡輔助T細胞（TFH）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）。每個亞群的譜系定型均由特定的"主轉(zhuǎn)錄因子"及其調(diào)控的效應(yīng)細胞因子所定義【1,2】。 其中一種對T細胞發(fā)育和分化至關(guān)重要的特定核轉(zhuǎn)錄因子是TOX，其屬于TOX家族（包括TOX、TOX2、TOX3和TOX4）的重要成員。該蛋白最初在胸腺細胞發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)，是CD4+胸腺細胞發(fā)育、自然殺傷細胞（NK細胞）分化以及固有淋巴細胞（ILC）從共同淋巴祖細胞分化所必需的關(guān)鍵調(diào)控因子。在胸腺發(fā)育過程中，TOX作為上游調(diào)控因子激活ThPOK的表達，從而決定CD4+T細胞譜系的定向分化【3】。目前， TOX在CD8+ T細胞生物學(xué)中的功能已被廣泛研究，在腫瘤和慢性感染等持續(xù)性抗原刺激條件下，CD8+ T細胞中的TOX高表達，并通過上調(diào)抑制性受體來介導(dǎo)T細胞耗竭和維持其存活【4】。然而， TOX在CD4+ T細胞中的表達模式、調(diào)控機制及其功能意義仍然不甚明確。

近日，來自美國斯隆·凱特林研究所的Andrea Schietinger團隊在Nature Immunology上在線發(fā)表題為TOX drives CD4+ TH1 effector function, antitumor immunity and autoimmune pathology的文章，系統(tǒng)研究了TOX在外周CD4+ T細胞分化及輔助T細胞命運定型中的作用，發(fā)現(xiàn)TOX在小鼠和人類的TH1細胞譜系中均高表達，且是TH1細胞效應(yīng)功能所必需的，尤其是對于IFNγ的產(chǎn)生至關(guān)重要，并且與增強的抗腫瘤免疫、對免疫療法的響應(yīng)以及自身免疫性疾病和炎癥性疾病中的致病性反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果為理解CD4+ T細胞的譜系特異性調(diào)控機制提供了新的視角，也為優(yōu)化基于T細胞的免疫治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

為了探究TOX在CD4+ T細胞分化中的作用，研究者通過體外極化實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人類的多種輔助T細胞亞群中，TOX均在TH1細胞中表達水平最高。在PR8流感病毒感染的小鼠模型中，病毒特異性TH1細胞同樣高表達TOX，且產(chǎn)生IFNγ的效應(yīng)TH1細胞亞群中TOX表達尤為顯著。進一步的動力學(xué)分析顯示，TOX在TH1極化后48小時開始表達，早于IFNγ的產(chǎn)生。同時，研究表明，TOX的誘導(dǎo)依賴于TCR信號（需NF-κB、AP1和NFAT協(xié)同激活）以及CD28共刺激信號，而IL-12信號雖非TOX誘導(dǎo)所必需，卻是IFNγ產(chǎn)生的關(guān)鍵。使用FK506抑制NFAT信號可完全阻斷TOX表達和IFNγ產(chǎn)生，證實TOX位于TCR-NFAT信號軸下游。此外，在淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）慢性感染和B16-GP61腫瘤模型中，經(jīng)歷持續(xù)抗原刺激的抗原特異性CD4+ T細胞同樣高表達TOX并維持IFNγ產(chǎn)生，表明在體內(nèi)慢性炎癥和腫瘤微環(huán)境中，TOX高表達是TH1細胞的標志性特征并與效應(yīng)功能密切相關(guān)。

為了了解TOX是否對TH1細胞效應(yīng)器功能起關(guān)鍵作用，研究人員隨后進行了功能獲得和功能缺失實驗。實驗結(jié)果顯示，過表達TOX使得 CD4+ T細胞中IFNγ產(chǎn)生顯著增加，而TNF、IL-17A和IL-4等其他譜系細胞因子未受影響，且pSTAT1、pSTAT4和T-bet表達水平無變化，提示TOX可以特異性增強TH1細胞效應(yīng)功能。此外，通過dLck-Cre系統(tǒng)在TCR轉(zhuǎn)基因SMARTA（TCR SMARTA ）小鼠模型（該小鼠的CD4+ T細胞經(jīng)過基因工程改造，使其TCR能夠特異性識別LCMV的GP61-80表位）中特異性敲除Tox基因，將初始TOX敲除或野生型TCR SMARTA CD4+ T細胞過繼轉(zhuǎn)移至B16-GP61荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)TOX敲除不影響CD4+ T細胞的激活和增殖，但導(dǎo)致抑制性受體PD-1和LAG3表達下降，更重要的是IFNγ產(chǎn)生能力嚴重受損，而TNF產(chǎn)生保留。同時，TOX敲除后T-bet表達未受影響，但EOMES、pSTAT1和pSTAT4水平顯著降低，且晚期CD4+ T細胞顯著減少，提示TOX可能通過STAT信號通路調(diào)控TH1細胞效應(yīng)功能和存活。利用CRISPR-Cas9技術(shù)在原代初始CD4+ T細胞中急性敲除Tox并過繼轉(zhuǎn)移至荷瘤小鼠，同樣證實TOX缺失導(dǎo)致IFNγ產(chǎn)生能力喪失。總之，這些數(shù)據(jù)揭示了TOX選擇性地調(diào)節(jié)外周CD4+ T細胞中TH1細胞因子IFNγ的產(chǎn)生。

為深入揭示TOX在CD4+ T細胞中驅(qū)動TH1效應(yīng)功能的分子機制， 研究人員 對過繼轉(zhuǎn)移至B16-GP61荷瘤小鼠第11天的野生型與TOX敲除TCR SMARTA 細胞進行了多組學(xué)分析。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，TOX敲除后TH1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Stat1、Stat4、Nfatc2、Ets1和效應(yīng)分子Ifng表達下調(diào)，而TCR信號負調(diào)控因子Nfkbid等表達上調(diào)。ATAC-seq發(fā)現(xiàn)，TOX敲除導(dǎo)致Ifng位點附近的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域——包括遠端增強子CNS-34和長鏈非編碼RNA Tmevpg1基因座——染色質(zhì)可及性喪失，且這些區(qū)域高度富集ETS和NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序。為進一步明確TOX的直接靶點，研究人員對來自B16-GP61荷瘤小鼠的表達TOX的CD4+ TCR SMARTA 細胞進行了CUT&RUN分析，發(fā)現(xiàn)TOX直接結(jié)合于多個IFNγ正向調(diào)控基因位點，包括Tmevpg1、Stat4、Stat1、Nfkb1、Nfatc2和Ets1。研究人員還發(fā)現(xiàn)。TOX敲除后NF-κB1蛋白水平降低，而NF-κB激動劑可部分恢復(fù)IFNγ產(chǎn)生。以上結(jié)果表明，TOX通過直接結(jié)合并調(diào)控多個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因位點，協(xié)同維持TH1細胞效應(yīng)分子的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄活性，從而驅(qū)動CD4+ T細胞的TH1效應(yīng)功能。

以上 數(shù)據(jù)表明，TOX在CD4+和CD8+ T細胞中可能發(fā)揮相反的功能，為此，研究人員比較了兩種細胞中TOX調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序。RNA-seq分析顯示，僅139個差異表達基因在兩個譜系中重疊，包括共同下調(diào)的抑制性受體（Tigit、Pdcd1）和共同上調(diào)的TCR信號負調(diào)控因子（Nfkbid、Egr2），表明TOX在兩個譜系中共同發(fā)揮驅(qū)動激活和增強TCR信號的核心功能。然而，TOX在CD4+ T細胞中特異性調(diào)控TH1細胞因子程序，表現(xiàn)為ETS和NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子表達及下游活性顯著降低，而CD8+敲除細胞中則表現(xiàn)為E2F家族和Hic1的活性差異。為進一步解析TOX在兩種細胞中功能差異的機制，研究人員對腫瘤來源的TOX陽性CD4+和CD8+ T細胞進行了CUT&RUN分析。結(jié)果顯示，TOX在兩種細胞系中共同結(jié)合于干細胞相關(guān)基因位點，提示TOX在TCR信號下游被誘導(dǎo)后通過抑制干細胞相關(guān)基因表達，使T細胞退出初始/干細胞樣狀態(tài)。而在CD4+ T細胞中，TOX特異性結(jié)合于Nfatc2及NF-κB信號驅(qū)動因子和ETS靶基因等基因位點。這些發(fā)現(xiàn)表明TOX通過NFAT、NF-κB、ETS轉(zhuǎn)錄因子和STAT信號的協(xié)同作用，特異性調(diào)控CD4+ T細胞中TH1細胞的IFNγ產(chǎn)生。

最后， 鑒于TOX在人類腫瘤中被定義為CD8+ T細胞耗竭的主轉(zhuǎn)錄因子并與免疫治療抵抗相關(guān)，研究人員探究了TOX在人類CD4+ T細胞中是否與增強的抗腫瘤免疫相關(guān)。通過對接受免疫治療的肝細胞癌和膀胱癌患者單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，臨床應(yīng)答者中CXCL13+ CD4+ T細胞群富集TOX和IFNG表達，且TOX與IFNG呈正相關(guān)，提示TOX+ CD4+ T細胞標記了一群產(chǎn)生IFNγ的細胞毒性CD4+ T細胞亞群，與免疫治療的良好響應(yīng)相關(guān)。在自身免疫性血管炎患者單細胞數(shù)據(jù)中，致病性細胞毒性CD4+ T細胞亞群同樣高表達TOX和IFNG，且該亞群對CD4 TOX特征的富集程度高于CD8 TOX特征。研究人員還在自身免疫性糖尿病NOD小鼠模型中驗證，胰腺中針對雜交胰島素肽的致病性CD4+ T細胞也高表達TOX并產(chǎn)生IFNγ和TNF。這些結(jié)果表明，TOX+ CD4+ T細胞不僅在人類腫瘤中與抗腫瘤免疫和免疫治療響應(yīng)相關(guān)，也在自身免疫和炎癥性疾病中與致病性反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。

綜上所述， 本研究揭示了TOX在CD4+ T細胞中的全新關(guān)鍵作用——作為TH1細胞分化的核心驅(qū)動因子，通過直接調(diào)控Stat1、Stat4、Nfkb1及Tmevpg1等基因，維持Ifng位點染色質(zhì)可及性，從而促進IFNγ產(chǎn)生。與CD8+ T細胞中TOX介導(dǎo)耗竭不同，CD4+ T細胞中TOX驅(qū)動效應(yīng)功能并與抗腫瘤免疫及免疫治療響應(yīng)正相關(guān)，但也參與自身免疫疾病的致病過程。這一發(fā)現(xiàn)重新定義了TOX的生物學(xué)功能，為靶向CD4+ T細胞的免疫治療策略提供了新思路。

https://doi.org/10.1038/s41590-026-02453-2

制版人： 十一

參考文獻

1. Kaech, S. M. & Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation.Nat. Rev. Immunol.12, 749–761 (2012).

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4. Scott, A. C. et al. TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation.Nature571, 270–274 (2019).

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