瘧原蟲疫苗的關(guān)鍵推手！γδ T細(xì)胞靠IL-4激活CD8+ T細(xì)胞免疫

摘要：研究以瘧原蟲子孢子這一弱免疫原為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)小鼠中Vγ1+ γδ T細(xì)胞是啟動(dòng)CD8+ T細(xì)胞抗瘧免疫的核心。該細(xì)胞分泌的IL-4與IFNγ、CD4+ T細(xì)胞的CD40L協(xié)同，誘導(dǎo)cDC1產(chǎn)生IL-12；IL-4和IL-12又直接作用于CD8+ T細(xì)胞，提升其IL-12受體表達(dá)并促進(jìn)擴(kuò)增。人類中Vγ9+Vδ2+ γδ T細(xì)胞在瘧原蟲感染時(shí)也會(huì)分泌IL-4，這一機(jī)制為弱免疫原引發(fā)有效CD8+ T細(xì)胞免疫提供了全新思路，也為瘧原蟲疫苗研發(fā)指明了方向。

一、瘧原蟲免疫，γδ T細(xì)胞是CD8+ T細(xì)胞的啟動(dòng)前提

瘧原蟲子孢子屬于弱免疫原，其誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞免疫高度依賴CD4+ T細(xì)胞輔助，而γδ T細(xì)胞的作用此前一直不明。實(shí)驗(yàn)中敲除γδ T細(xì)胞的小鼠，經(jīng)輻射減毒瘧原蟲子孢子（RAS）免疫后，抗原特異性CD8+ T細(xì)胞在脾臟、肝臟及引流淋巴結(jié)的早期擴(kuò)增顯著受損，后續(xù)記憶細(xì)胞（包括肝駐留記憶T細(xì)胞TRM）的形成也嚴(yán)重缺陷（圖1）。

圖1：γδ T 細(xì)胞對(duì)輻射減毒瘧原蟲子孢子（RAS）誘導(dǎo)的抗原特異性 CD8+ T 細(xì)胞應(yīng)答至關(guān)重要

即使補(bǔ)充抗原特異性CD4+ T細(xì)胞，無γδ T細(xì)胞的小鼠中CD8+ T細(xì)胞的應(yīng)答仍無法恢復(fù)，這說明γδ T細(xì)胞是瘧原蟲免疫中CD8+ T細(xì)胞激活的必要條件，且作用獨(dú)立于CD4+ T細(xì)胞的初始輔助。

二、Vγ1+ γδ T細(xì)胞，是啟動(dòng)免疫的核心亞群

γδ T細(xì)胞的激活存在明顯的時(shí)間窗口，RAS免疫后24小時(shí)內(nèi)是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵時(shí)期。小鼠脾臟中Vγ1+ γδ T細(xì)胞在免疫后1天就顯著上調(diào)CD69、CD25等激活標(biāo)志物，細(xì)胞數(shù)量和活化比例短暫且快速升高（圖2，來源：原文Fig.2）。

圖2：RAS 免疫后 Vγ1+ γδ T 細(xì)胞在脾臟中快速活化

阻斷Vγ1+ γδ T細(xì)胞的功能，其對(duì)CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的抑制效果，與阻斷整個(gè)γδ T細(xì)胞群體幾乎一致；而Vγ1- γδ T細(xì)胞的活化則相對(duì)微弱，且并非免疫啟動(dòng)的核心。這一結(jié)果直接鎖定Vγ1+ γδ T細(xì)胞為介導(dǎo)瘧原蟲免疫啟動(dòng)的關(guān)鍵亞群。

三、抗原呈遞正常，γδ T細(xì)胞的作用不在此環(huán)節(jié)

既然γδ T細(xì)胞是免疫啟動(dòng)的關(guān)鍵，研究者首先驗(yàn)證其是否影響cDC1的抗原呈遞功能。將OVA特異性O(shè)T-I細(xì)胞轉(zhuǎn)入敲除γδ T細(xì)胞的小鼠，經(jīng)RAS免疫后，OT-I細(xì)胞能正常上調(diào)CD69、發(fā)生初始增殖，脾臟中抗原呈遞相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)無明顯差異（圖3，來源：原文Fig.3）。

圖 3：γδ T 細(xì)胞不影響 cDC1 向 CD8+ T 細(xì)胞的抗原呈遞功能

這說明γδ T細(xì)胞并不影響cDC1向CD8+ T細(xì)胞呈遞抗原的過程，其作用并非在免疫啟動(dòng)的抗原識(shí)別階段，而是在后續(xù)的細(xì)胞活化、擴(kuò)增環(huán)節(jié)，大概率與細(xì)胞因子信號(hào)或共刺激信號(hào)相關(guān)。

四、IL-4，是γδ T細(xì)胞發(fā)揮作用的核心細(xì)胞因子

此前推測(cè)γδ T細(xì)胞可能通過提供CD40L輔助cDC1活化，但實(shí)驗(yàn)證明CD4+ T細(xì)胞是CD40L的主要來源，γδ T細(xì)胞的CD40L并非必需。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RAS免疫后Vγ1+ γδ T細(xì)胞會(huì)分泌IL-4和IFNγ，而Vγ1- γδ T細(xì)胞僅分泌IFNγ（圖4）。

圖4：Vγ1+ γδ T 細(xì)胞在 RAS 免疫后分泌 IL-4 和 IFNγ，而 Vγ1- γδ T 細(xì)胞僅分泌 IFNγ

阻斷IL-4或使用IL-4敲除小鼠，CD8+ T細(xì)胞的應(yīng)答缺陷與γδ T細(xì)胞敲除小鼠完全一致；而阻斷IFNγ僅輕微影響CD8+ T細(xì)胞擴(kuò)增，且γδ T細(xì)胞并非IFNγ的必要來源。補(bǔ)充IL-4充足的CD4+ T細(xì)胞，也無法恢復(fù)IL-4敲除小鼠的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，說明γδ T細(xì)胞是免疫啟動(dòng)中IL-4的核心來源。

五、小鼠到人，γδ T細(xì)胞分泌IL-4是保守機(jī)制

為驗(yàn)證γδ T細(xì)胞是IL-4的直接來源，研究者用IL-4報(bào)告小鼠發(fā)現(xiàn)，RAS免疫后23小時(shí)，脾臟中Vγ1+ γδ T細(xì)胞是分泌IL-4的主要群體，肝臟中則未檢測(cè)到該現(xiàn)象（圖5）。

圖5：Vγ1+ γδ T 細(xì)胞是 RAS 免疫后脾臟中 IL-4 的主要來源，且 IL-4 直接作用于 cDC1 和 CD8+ T 細(xì)胞

將野生型γδ T細(xì)胞轉(zhuǎn)入敲除小鼠，能完全恢復(fù)CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答；而轉(zhuǎn)入IL-4敲除的γδ T細(xì)胞，則無恢復(fù)效果。人類中，瘧原蟲感染患者的Vγ9+Vδ2+ γδ T細(xì)胞分泌IL-4的比例，遠(yuǎn)高于健康人群，且該細(xì)胞表達(dá)CXCR5、CCR7等淋巴組織歸巢受體，與小鼠中Vγ1+ γδ T細(xì)胞的功能特征高度相似。

六、IL-4雙向作用，同時(shí)調(diào)控cDC1和CD8+ T細(xì)胞

IL-4對(duì)CD8+ T細(xì)胞免疫的調(diào)控是雙向直接作用的。一方面，敲除CD8+ T細(xì)胞的IL-4受體（IL-4Rα），其在RAS免疫后的擴(kuò)增顯著受損；另一方面，敲除cDC1的IL-4Rα，cDC1介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞活化也無法正常進(jìn)行（圖5）。

圖6：IL-4 與 IFNγ、CD40L 協(xié)同誘導(dǎo) cDC1 產(chǎn)生 IL-12，且 IL-12 對(duì) CD8+ T 細(xì)胞應(yīng)答至關(guān)重要

在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-4與IFNγ、CD40L協(xié)同作用于cDC1，能顯著上調(diào)Il12a基因的表達(dá)，誘導(dǎo)cDC1產(chǎn)生生物活性的IL-12；而IL-12是CD8+ T細(xì)胞擴(kuò)增和分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，阻斷IL-12會(huì)導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的嚴(yán)重缺陷（圖6）。

七、IL-4與IL-12協(xié)同，放大CD8+ T細(xì)胞的免疫應(yīng)答

IL-4和IL-12在CD8+ T細(xì)胞的活化中存在顯著的協(xié)同效應(yīng)。體外培養(yǎng)中，單獨(dú)加入IL-4或IL-12，對(duì)PbT-I細(xì)胞的擴(kuò)增僅有輕微促進(jìn)；而兩者共同加入時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)增效率大幅提升（圖7）。

圖7：IL-4 與 IL-12 協(xié)同促進(jìn) CD8+ T 細(xì)胞擴(kuò)增，并介導(dǎo)肝駐留記憶 T 細(xì)胞（TRM）形成

這一協(xié)同效應(yīng)的核心機(jī)制是，IL-4與IL-12共同作用能顯著上調(diào)CD8+ T細(xì)胞表面IL-12受體的表達(dá)，提升細(xì)胞對(duì)IL-12的敏感性。在體內(nèi)，只有存在IL-4（或γδ T細(xì)胞）時(shí)，CD8+ T細(xì)胞才能正常上調(diào)IL-4Rα和IL-12R，實(shí)現(xiàn)有效的免疫擴(kuò)增。

八、IL-4介導(dǎo)形成肝駐留記憶T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)抗瘧保護(hù)

瘧原蟲感染的保護(hù)作用主要依賴肝駐留記憶T細(xì)胞（TRM），而γδ T細(xì)胞分泌的IL-4是TRM形成的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)阻斷IL-4和IL-12，小鼠肝臟中TRM的形成缺陷與阻斷γδ T細(xì)胞幾乎一致；其中IL-4對(duì)TRM形成的作用占主導(dǎo)地位（圖7）。

γδ T細(xì)胞分泌的IL-4，通過誘導(dǎo)cDC1產(chǎn)生IL-12，再與IL-12共同作用于CD8+ T細(xì)胞，促進(jìn)其擴(kuò)增并分化為TRM。這一過程讓弱免疫原的瘧原蟲子孢子，成功突破免疫啟動(dòng)閾值，形成具有保護(hù)作用的特異性CD8+ T細(xì)胞免疫。

九、研究的背后，是弱免疫原免疫的全新思路

這一研究最有價(jià)值的地方，是解開了弱免疫原如何有效啟動(dòng)CD8+ T細(xì)胞免疫的謎題。瘧原蟲子孢子無法通過PRR信號(hào)充分激活cDC1，而γδ T細(xì)胞分泌的IL-4，成為了補(bǔ)充的“激活信號(hào)”，與CD40L、IFNγ協(xié)同讓cDC1達(dá)到激活閾值。

從小鼠的Vγ1+ γδ T細(xì)胞到人類的Vγ9+Vδ2+ γδ T細(xì)胞，IL-4介導(dǎo)的這一機(jī)制具有保守性。這不僅為瘧原蟲疫苗的研發(fā)提供了新靶點(diǎn)——靶向激活γδ T細(xì)胞分泌IL-4，也為腫瘤、其他弱免疫原相關(guān)疾病的免疫治療，提供了全新的思路和方向。

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