Nature Commun｜浙江大學許軍/李學坤揭示抗癌老藥放線菌素D如何“卡住”基因轉錄的喉嚨

短串聯重復序列（STRs）占人類基因組的6%，它們的轉錄異常與60多種疾病密切相關，包括肌萎縮側索硬化、亨廷頓舞蹈病、強直性肌營養不良1型以及多種癌癥。這些STRs的轉錄會產生毒性RNA，通過形成核內聚集體捕獲關鍵RNA結合蛋白，或通過非經典翻譯產生毒性蛋白，最終導致神經元功能紊亂。放線菌素D（ACTD）是首個獲批臨床應用的抗癌抗生素，六十年來一直用于治療多種兒童惡性腫瘤，近年研究發現它能抑制與強直性肌營養不良1型相關的CTG重復序列轉錄，展現出治療神經退行性疾病的潛力。然而，ACTD的高毒性限制了其臨床應用，人們對其如何抑制真核RNA聚合酶II轉錄的分子機制仍知之甚少。

2026年3月17日，浙江大學醫學院附屬兒童醫院李學坤教授與浙江大學轉化醫學研究院許軍研究員聯合團隊在《Nature Communications》發表了題為“Stepwise transcription stalling by the anti-cancer drug Actinomycin D and insights into short tandem repeat transcription inhibition”的研究論文。該研究通過重構酵母和哺乳動物轉錄系統，首次揭示了ACTD誘導RNA聚合酶II在三個不同狀態逐步停滯的分子機制，并解析了ACTD與CTG重復序列相互作用的高分辨率結構。

研究團隊首先利用重構的體外轉錄系統發現，ACTD并非均勻地抑制所有GpC位點，而是在EGFR基因的GC富集序列中誘導聚合酶在特定位置停滯。當使用含有單個高親和力TGCA基序的DNA模板時，ACTD能完全阻斷轉錄延伸，聚合酶主要在結合位點上游的n-5、n-2和n-1三個位置停滯，其中n-1是主要停滯位點。通過突變實驗證實，這些多重重疊的停滯條帶反映了單個ACTD分子被聚合酶逐步接近的不同階段。

通過單顆粒冷凍電鏡技術，研究人員解析了ACTD誘導聚合酶停滯的三個高分辨率結構。在n-5位置的“遭遇復合物”結構中，ACTD的吩噁嗪酮環插入+6和+7核苷酸之間，其α環與Rpb1亞基switch-1基序的氨基酸殘基靠近，這是聚合酶首次感知到ACTD存在的瞬間。在n-2位置的“接合復合物”結構中，ACTD插入+4和+5之間，此時switch-1基序的T1385、R1386和H1387分別與ACTD的α環和β環發生直接相互作用。

在n-1位置的“阻滯復合物”結構中，ACTD插入+3和+4之間，與聚合酶形成更為廣泛的相互作用網絡：K1102與α環形成氫鍵，switch-1基序的R1836和H1387與β環形成氫鍵，橋螺旋的Y836和switch-1的T1385分別與α環和β環形成疏水相互作用。Y836的體積效應和多重相互作用共同阻止ACTD跨越橋螺旋，從而完全阻斷聚合酶的前進。

ACTD的結合顯著改變了下游DNA的構象。在n-5結構中，ACTD將模板鏈向主通道推移約11.4?；在n-2結構中，主要將非模板鏈推移約10.5?；而在n-1結構中，對兩條鏈產生均衡的推移作用。DNA結構參數分析顯示，ACTD顯著改變了被覆蓋區域的roll角和twist角。更重要的是，ACTD誘導的DNA構象變化破壞了DNA與switch-1基序及Rpb5 jaw結構域的相互作用。TFIIS切割實驗證實，ACTD確實能誘導聚合酶發生回溯，這是導致持久性停滯的關鍵機制。

這種轉錄抑制機制在進化上高度保守。使用與人類聚合酶序列同源性超過99%的牛Pol II進行的實驗顯示，ACTD誘導出與酵母完全一致的停滯模式，n-1同樣是最主要的持久停滯位點。2.6?分辨率的牛Pol II-ACTD復合物結構證實，從聚合酶的移位狀態、下游DNA構象到ACTD與聚合酶之間的精細相互作用，所有關鍵特征都與酵母系統驚人地一致。

針對五種疾病相關的GC富集STRs的系統評估顯示，ACTD表現出顯著的亞型選擇性抑制效應。對于引起強直性肌營養不良1型的CTG重復和亨廷頓舞蹈病的CAG重復，0.1μM的ACTD就能抑制約80%的轉錄；而對于引起脆性X相關震顫/共濟失調綜合征的CGG重復、強直性肌營養不良2型的CCUG重復以及肌萎縮側索硬化的GGGGCC重復，則需要十倍高的濃度才能達到類似抑制效果。這種選擇性差異與ACTD的DNA結合親和力直接相關。

以CTG重復為模型，研究發現ACTD對聚集的重復序列具有加合性抑制效應。當模板中含有兩個或三個ACTD結合位點時，相同濃度的ACTD表現出顯著更強的抑制效果，形成的抑制復合物也更為穩定。冷凍電鏡結構揭示，兩個ACTD分子之間通過肌氨酸和甲基纈氨酸側鏈形成兩對范德華相互作用，三個ACTD分子之間則形成更復雜的疏水相互作用網絡。這些分子間相互作用提供了額外的穩定性，解釋了為什么更低濃度的ACTD就能有效抑制含有聚集結合位點的STRs轉錄。值得注意的是，第一個ACTD深埋于聚合酶主通道中，第二個被部分覆蓋，而第三個幾乎不與聚合酶相互作用，這種差異化的結合模式解釋了第三個ACTD對轉錄抑制貢獻較小的原因。

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