Targetome I 鎖定CMPK2，毛蕊花糖苷如何打斷肝缺血再灌注損傷的惡性循環？(北京中醫藥大學-李曉驕陽團隊)

2026年3月31日，北京中醫藥大學李曉驕陽教授以獨立通訊在Targetome (Targetome是中國藥科大學的官方期刊，該期刊致力于聚焦開創性研究，旨在發現具有轉化潛力的新型治療靶點，推動藥物研發創新，并促進精準醫學的發展。)在線發表題為“Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism”（毛蕊花糖苷通過靶向 CMPK2 介導的氧化還原代謝來減輕肝臟缺血再灌注損傷）的研究論文。

【通訊作者】李曉驕陽，北京中醫藥大學教授、博導、博士后合作導師、美國弗吉尼亞聯邦大學博士后及高級訪問學者，現任北京中醫藥大學科研處副處長兼任期刊中心副主任。 獲得國家高層次人才特殊支持計劃、青年岐黃學者、全球前2%頂尖科學家、北京市科技新星、中華中醫藥學會青年科技創新獎獲得者、中華中醫藥學會青年人才托舉工程（A類）獲得者、北京中醫藥大學人才A崗及壺天青年學者。現為國家中醫藥管理局高水平中醫藥重點學科中醫疫病學學科方向帶頭人、國家中醫藥傳承創新團隊、北京中醫藥薪火傳承“新3+3”工程趙紹琴“三名”傳承工作室重點培養人才。兼任中華中醫藥學會感染病分會副秘書長、中華中醫藥學會肝膽病分會青年副主任委員、中華中醫藥學會青年委員會委員等。

研究方向：中醫藥防治慢性肝病（肝纖維化、非酒精性脂肪肝、肝癌等）功效機理解析

主要成果：主持10余項國家及省部級題，以通訊或第一作者在Journal of Hepatology、Science Bulletin、Hepatology、Theranostics、APSB等知名期刊發表論文90余篇（IF＞10分25篇），他引3800余次（2篇ESI高被引，3次獲Editorial Comments，3次獲封面文章）。依托相關成果入選國際F1000Prime庫、梅斯醫學中國十大醫學研究、中國精品科技期刊頂尖學術論文F5000、國際中醫藥與傳統醫藥高影響力研究、美國肝病協會組委會研究獎及青年科學研究學者獎。授權專利19項、軟著3項、團標3項，獲得教育部科學研究優秀成果獎二等獎、省科學技術進步一等獎2次及中華中醫藥學會青年科技創新獎等。作為指導教師指導學生入選中國科協首屆青年人才托舉工程博士生專項計劃、北京中醫藥大學“壺天博士后計劃”，獲國家自然科學基金博士后面上項目、國家資助博士后研究人員計劃和國家自然科學基金青年項目、10人次研究生國家獎學金。

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【摘 要】

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是肝臟手術和肝移植后不可避免的并發癥。胞嘧啶單磷酸激酶2（CMPK2）在調控線粒體DNA（mtDNA）合成和氧化還原代謝中發揮著至關重要的作用，但其在HIRI中的作用及其潛在治療手段仍不明確。我們通過整合測序技術和多種分子生物學實驗證實，在HIRI的起始階段，過量的酰基輔酶A（Acly-CoA）促進了酰基輔酶A硫酯酶2依賴的線粒體游離脂肪酸的合成和積累，從而促進了肝細胞中活性氧（ROS）的產生。在氧化應激反應中，CMPK2刺激mtDNA的合成和氧化，mtDNA進一步通過開放的線粒體通透性轉換孔（mPTP）釋放，并以自分泌的方式激活TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信號通路。我們隨后證實，毛蕊花苷（ACT）在體內外均能顯著保護CMPK2介導的氧化還原代謝，并能緩解缺血再灌注損傷（HIRI）。機制上，ACT抑制IRF1核轉位，從而抑制Cmpk2和Duox2的轉錄，防止活性氧（ROS）的產生和線粒體DNA（mtDNA）的泄漏。此外，ACT還能結合CMPK2并促進其線粒體自噬依賴性的降解。值得注意的是，在肝細胞中特異性過表達CMPK2可阻斷ACT的治療作用。綜上所述，我們的研究結果表明CMPK2是HIRI中氧化還原失調的關鍵驅動因素，并強調ACT作為一種多靶點治療藥物具有臨床轉化潛力。

01

研究背景及科學問題

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是一種重要的病理生理過程，其特征是過度氧化應激、代謝失衡和炎癥，發生在肝臟經歷氧氣和營養供應不足一段時間后，隨后血流恢復時[ 1 ]。它是多種臨床情況下不可避免的并發癥，例如肝切除或肝移植，并可能導致嚴重的后果，包括圍手術期全身炎癥反應綜合征和多器官功能衰竭[ 2 ]。HIRI的發病機制通常包括兩個階段。在初始缺血階段，血流受限會誘發細胞代謝紊亂，導致活性氧（ROS）過度生成、線粒體膜電位（MMP）崩潰和肝毒性[ 3 ]。血液再灌注會通過誘導內源性損傷相關分子模式（DAMPs）的釋放，例如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）或線粒體DNA（mtDNA），進而激活Toll樣受體（TLRs） ，從而進一步加劇氧化應激和炎癥[ 4 ]。目前避免或減輕缺血再灌注損傷（HIRI）的臨床策略主要集中于縮短缺血時間、采用缺血預適應或及時使用藥物干預。然而，現有的抗氧化劑和線粒體保護劑對HIRI的保護作用有限，這構成了一個亟待解決的重大臨床挑戰。

線粒體及其相關的代謝過程同時影響著氧化應激、代謝紊亂和炎癥反應之間的復雜相互作用。我們最近發現，肝缺血再灌注損傷（HIRI）會引發三磷酸腺苷（ATP）合成的破壞、活性氧（ROS）的爆發性積累以及線粒體動力學失衡，最終導致肝細胞能量危機[ 5 ]。既往研究強調，在缺血期，線粒體功能障礙與脂質代謝紊亂相關，且發生在HIRI的炎癥事件和細胞死亡之前[ 6 ] 。有趣的是，游離脂肪酸（FFA）誘導的脂質沉積也會刺激肝細胞中ROS的爆發和氧化應激，并對線粒體功能產生反向影響[ 7 ]。此外，脂質-活性氧（ROS）積累和線粒體功能障礙協同加速線粒體DNA （mtDNA）的氧化和釋放[ 8 , 9 ] ，進一步形成以脂質代謝紊亂、線粒體氧化還原功能障礙和炎癥加劇為特征的惡性循環[ 10 , 11 ] 。因此，識別同時影響線粒體脂質代謝和以mtDNA為中心的氧化應激的關鍵通路，可能直接減輕與缺血再灌注損傷（HIRI）相關的損害。胞嘧啶單磷酸激酶2（CMPK2）主要定位于線粒體，是合成脫氧核苷三磷酸以調節mtDNA復制的限速酶[ 12 ]。據報道，敲低CMPK2可以減少mtDNA釋放到胞質溶膠中[ 13 ]。最近有報道稱，CMPK2在代謝性肝病患者的肝臟中顯著上調。此外，肝細胞特異性敲除Cmpk2可顯著抑制炎癥和隨后的肝細胞焦亡[ 14 ]，但其在肝缺血再灌注損傷（HIRI）發展中的確切功能仍不明確。

許多天然產物因其廣泛的生物活性、較高的安全性以及長期使用副作用極小而備受關注，有望為肝損傷相關炎癥（HIRI）的治療帶來新的希望。臨床前研究表明，白藜蘆醇、人參皂苷、姜黃素、丹酚酸以及三七總皂苷均具有抗氧化和抗炎作用，并能調節HIRI中的代謝紊亂，無論單獨使用還是與其他藥物聯合使用[ 15 , 16 ] 。毛蕊花苷（ACT）是一種廣泛存在于肉蓯蓉和地黃等傳統中藥中的苯丙素苷，因其對多種肝臟疾病的抗氧化、抗炎和抗凋亡特性而日益受到關注。我們之前的研究表明，ACT抑制了受損肝細胞來源的DAMPs的合成和向肝竇內皮細胞（LSECs）的轉移，從而逆轉了LSEC的衰老并改善了HIRI中的肝竇微環境[ 4 ]。此外，我們最近證實，ACT增強了poly(RC)結合蛋白2 (PCBP2)-系統Xc?的結合親和力，從而通過限制缺氧誘導因子1α (HIF-1α)和p300，限制了HIRI期間HMGB1誘導的肝細胞鐵死亡、M1巨噬細胞募集和免疫反應[ 17 ]。盡管已初步觀察到 ACT 與肝細胞保護作用之間的關聯，但仍需進一步證實 CMPK2 在脂質代謝異常、氧化應激和 HIRI 發展中的確切功能，以及闡明 ACT 的具體作用方式。

本研究綜合運用體內HIRI小鼠模型、體內肝細胞特異性Cmpk2過表達模型和體外缺氧復氧（HR）模型，結合全肝及單細胞RNA測序（RNA-Seq）和一系列分子生物學實驗，深入探究了ACT如何通過調控TLR9-干擾素調節因子1（IRF1）-CMPK2/雙氧化酶2（DUOX2）-線粒體DNA軸，改善氧化還原代謝，并阻斷HIRI中以CMPK2為中心的脂毒性-高氧化-炎癥惡性循環。本研究不僅為CMPK2在HIRI過程中線粒體脂質代謝與氧化還原失調相互作用中的病理作用提供了新的見解，而且有助于ACT從實驗室走向臨床應用，成為預防HIRI的一種極具前景的新策略。

02

重要發現及亮點

ACT的抗HIRI作用與肝臟線粒體氧化還原代謝的調節密切相關

我們初步表明，ACT可通過修復以PCBP2為中心的肝細胞鐵死亡和減輕肝竇內皮細胞（LSEC）衰老來改善肝缺血再灌注損傷（HIRI），而這兩者都與細胞代謝紊亂和氧化還原反應密切相關[ 4 , 17 ]。在此，我們進行了動物實驗，以進一步研究ACT對肝臟線粒體脂質代謝和氧化死亡模式的影響。如圖S1a所示，與血清轉氨酶升高相一致，HIRI顯著增加了炎癥浸潤、肝竇充血、水腫和以肝細胞為中心的細胞凋亡，這由TUNEL試劑和肝細胞核因子4α（HNF-4α）的共染色面積增加所證實（圖1a和b；圖S1b - S1d）。值得注意的是，ACT顯著逆轉了肝臟中與缺血性損傷和肝細胞死亡相關的病理現象。接下來，我們對不同組別的肝臟以及從肝組織中分離的單細胞類型肝細胞進行了RNA測序分析。利用這些不同的測序數據進行比較和相關性分析，從而篩選出核心靶點簇。如圖1c所示，HIRI組全肝中主要改變的功能注釋涉及ATP合成偶聯的電子傳遞、細胞凋亡過程和炎癥反應，而ACT顯著逆轉了這些過程。有趣的是，我們還觀察到，酰基輔酶A（Acyl-CoA）代謝過程、DNA代謝過程、脂質代謝過程以及線粒體細胞色素c的釋放和線粒體電子傳遞等類似的生物學過程在HIRI組中發生了顯著改變，但在ACT治療組中未發生改變（圖1d）。在對全肝和細胞水平的數據集進行比較和分析后，我們發現共同的關鍵靶點主要是Cmpk2和髓系分化原初反應蛋白88 ( Myd88 )（圖1c和d）。此外，我們進行了圖1e的分析，并重點介紹了ACT逆轉HIRI的關鍵過程，這些過程涉及內質網相關蛋白降解途徑、細胞凋亡執行階段、脂肪酸氧化和氧化磷酸化。此外，通過對體內和體外水平的RNA-seq數據進行交叉分析，我們鑒定了主要包括線粒體、脂質代謝過程和細胞凋亡過程在內的最關鍵通路（圖1f） 。最后，我們對肝組織和肝細胞進行了脂肪細胞分化相關蛋白（ADRP）染色，進一步闡明了ACT主要通過重新平衡線粒體中的脂質積累和氧化還原事件來干預脂質代謝過程（補充圖S2a和S2b）。

圖1. ACT減輕了HIRI小鼠和HR刺激的肝細胞的肝損傷。(a) 不同組別的H&E染色代表性圖像（箭頭指示肝損傷區域，包括炎癥灶）。比例尺 = 100 μm。(b) 不同組別的HNF-4α和TUNEL免疫組化染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(c) 和 (d) 分別為不同組別小鼠分離的全肝和原代肝細胞中關鍵差異表達基因（DEGs）的熱圖，紅色線條指示不同的基因簇。(e) 小鼠肝臟（上圖）和原代肝細胞（下圖）中HIRI組和HIRI+ACT組的基因集富集分析（GSEA）。(f) 以氣泡圖形式可視化的全肝和原代肝細胞差異表達基因的GO富集分析結果。

ACT影響由ACOT2控制的脂肪酸合成，并重塑線粒體氧化代謝

隨后，我們對原代肝細胞的RNA-seq數據進行了熱圖分析，重點關注參與脂質合成、轉運和代謝的基因，特別是酰基輔酶A硫酯酶（ACOTs）家族的基因。圖2a展示了差異表達基因（DEGs）的層級聚類結果。在HIRI組中，我們檢測到Acot2顯著上調，Acot2是肝細胞中負責將酰基輔酶A水解為游離脂肪酸（FFA）的靶基因，而其他ACOTs家族成員則未見上調。與此一致的是，HIRI小鼠肝臟中ACOT2的表達及其與線粒體標志物線粒體外膜20（TOM20）的共定位均增加，但在ACT治療后則逆轉（圖2b；補充圖S3a）。 AML12細胞中ACOT2的翻譯變化趨勢與小鼠肝臟中的變化趨勢相同（補充圖S3b）。由于ACOT2的強烈干預，HIRI手術后肝臟FFA含量顯著增加（圖2c ，上圖），更重要的是，其與小鼠肝臟中Acot2 mRNA表達的變化呈正相關（圖2d，上圖）。同時，ACT逆轉了HIRI手術引起的FFA積累，并打破了其與Acot2的正相關性。進一步分析顯示，在HR損傷和ACT給藥下，肝細胞中FFA含量及其與Acot2 mRNA的相關性均呈現相似的趨勢（圖2c和d，下圖）。此外，FFA的積累通常會通過多種途徑導致線粒體ROS的過度產生。如圖2e和f所示；補充圖S3c顯示，ACT減輕了HR誘導的ROS積累和氧化應激，其特征是DCFH-DA熒光面積和丙二醛（MDA）水平（脂質過氧化的典型標志物）降低，谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平（抗氧化能力的公認指標）升高。氧化反應對于維持線粒體穩態至關重要，它通過防止脂質沉積和促進呼吸作用產生能量來維持線粒體穩態。圖2g展示了與脂肪酸合成相關的FFA生物過程基因，例如酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員1（Acsl1）、脂肪酸轉運和氧化相關基因，如肉堿棕櫚酰轉移酶1a（Cpt1a）和酰基輔酶A氧化酶1（Acox1）。值得注意的是，與β相關的基因發生了變化。β-氧化尤其顯著。與此一致的是，HIRI或HR誘導的線粒體中FA β-氧化相關基因的mRNA表達下調，在ACT給藥后顯著恢復（圖2h）。此外，ACT處理的AML12細胞表現出比HR組更優的線粒體功能，表現為ATP水平升高以及線粒體復合物I和IV活性增強（圖2i）。這些結果表明，ACT通過降低ACOT2的表達來減少FFA的過度生成，并選擇性地重新激活ACOX1以恢復氧化代謝，從而重塑線粒體的氧化還原平衡。

圖2. ACT抑制ACOT2表達，進而導致線粒體氧化代謝紊亂。(a) 原代肝細胞中線粒體代謝相關基因的熱圖。(b) 小鼠肝臟中TOM20 (594 nm)、ACOT2 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(c) 小鼠肝臟和AML12細胞中游離脂肪酸(FFA)水平。(d) 小鼠肝臟和AML12細胞中FFA水平與Acot2基因表達的相關性分析。(e) AML12細胞中活性氧(ROS) (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(f) 小鼠肝臟中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平。(g) 原代肝細胞中脂肪酸β-氧化和酰基輔酶A代謝相關基因的熱圖。在小鼠肝臟和經ACT處理的AML12細胞中， Cpt1a、 Acox1和Acsl1的mRNA水平以Hprt1進行標準化。(i) AML12細胞中ATP水平以及線粒體復合物I和IV的活性。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數據以平均值±標準誤表示，細胞實驗n = 3，小鼠實驗 n = 6）。

ACT通過抑制CMPK2來阻止肝細胞中mtDNA的產生和釋放

氧化應激不僅會引發線粒體功能障礙，還會刺激損傷相關分子模式（DAMPs）的持續釋放。我們進行了環狀網絡圖分析，發現絕大多數差異表達基因（DEGs）都與核酸相關，包括Tlr9、Cmpk2和Irf1，它們主要影響HIRI組和HIRI+ACT組肝細胞中線粒體DNA（mtDNA）的識別、合成和調控（圖3a）。接下來，我們重點研究了mtDNA相關的氧化應激和線粒體功能的變化。差異表達基因的火山圖顯示，參與活性氧（ROS）和mtDNA產生及響應的基因，包括Cmpk2、Tlr2、Tlr9和Cxcl10，在HR損傷下顯著上調，但在ACT治療后則下調（圖3b）。在這些共同反映線粒體DNA（mtDNA）軸關鍵步驟的基因中，Cmpk2表現出最顯著且一致的 ACT 逆轉變化。在高活性氧（ROS）條件下，由于缺乏組蛋白保護且靠近氧化呼吸鏈，mtDNA 特別容易受到氧化損傷。這種脆弱性導致氧化型 mtDNA （ox-mtDNA）的產生增加[ 18 ]。隨后，通過 TOM20 與抗 DNA 或 8-OHdG 的共染色來可視化 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。如圖3c和補充圖 S4a和S4b所示，與同源重組（HR）刺激相比，ACT 顯著降低了 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。值得注意的是，在圖 3b中參與 mtDNA 相關生物學過程的各種差異表達基因（DEGs）中，我們發現Cmpk2與 mtDNA 合成的關聯最為密切。有趣的是，在HIRI或HR損傷后，全肝細胞和分離的線粒體中CMPK2蛋白水平顯著升高，而ACT干預可顯著降低其水平，尤其是在線粒體組分中（圖3d和e）。線粒體通透性轉換孔（mPTP）過度開放，是由電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1）介導的，會導致線粒體腫脹、嵴破壞，最終導致膜破裂。本研究采用mPTP抑制劑環孢素A（CsA）、mPTP開放激活劑（包括羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP，促進MMP去極化）和ATP（刺激VDAC寡聚化））來檢測mPTP的開放狀態[ 19 ]。ACT抑制了VDAC1介導的mtDNA釋放和mPTP的異常開放，表現為抗DNA抗體與VDAC1共定位的下調，以及Calcein熒光強度的恢復（圖3f和g；補充圖S4c）。同樣，我們發現，在HIRI或HR損傷后，ACT顯著降低了血清和條件培養基中mtDNA的含量和釋放量（圖3；補充圖S4d ）。如圖3i和補充圖S4e所示，JC-1和TMRE染色結果表明，在HR處理的肝細胞中觀察到了由MMP異常引起的肝細胞死亡，而在ACT處理的肝細胞中未觀察到。

圖3. ACT通過抑制CMPK2抑制缺氧肝細胞中mtDNA的合成和釋放。(a) DAMP分子環狀網絡圖。(b) HIRI組和HIRI+ACT組原代肝細胞中差異表達基因(DEG)表達的火山圖。(c) AML12細胞中TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、8-OHdG (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺=20 μm。(d)、(e) 小鼠肝臟和AML12細胞中全細胞和線粒體中CMPK2的蛋白表達水平以β-肌動蛋白或TOM20進行標準化。(f) AML12細胞中VDAC1 (594 nm)、抗DNA (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12 細胞中 Calcein AM (488 nm) 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(h) 左圖：小鼠血清中 mtDNA 水平；右圖：AML12 細胞培養基中 mtDNA 水平。(i) AML12 細胞中 JC-1 分析的流式細胞術結果。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數據以平均值 ± 標準誤表示，細胞實驗n = 3，小鼠實驗 n = 6）。

缺氧通過TLR9-MYD88-NF -κB信號通路 觸發IRF1的激活和核轉位，而ACT可完全阻斷這一過程

基于肝細胞特異性RNA測序數據分析主要反應受體譜后，我們預測，HR刺激后， TLR2等多種TLR表達顯著升高，而ACT干預后則降低。盡管HR組中TLR9和TLR7的表達水平并不高，但在ACT給藥后觀察到其表達顯著降低，尤其是TLR9基因的P值更高（圖4a）。值得注意的是，TLR9主要在內體中表達，并因其對細胞內和細胞外來源的mtDNA的反應而聞名[ 20 ]。雖然目前尚無文獻表明TLR2可以直接響應mtDNA，但它可能感知由mtDNA觸發的其他DAMPs [ 21 , 22 ]。 qPCR分析和多重免疫熒光染色均觀察到一致的結果，表明在HIRI小鼠肝臟和經HR處理的肝細胞（以肝細胞標志物HNF-4α或CK18標記）中TLR2和TLR9表達上調；然而，給予ACT后，TLR2和TLR9表達下調（圖4b和c；補充圖S5a - S5c ）。如圖4d和補充圖S6a所示，CsA引起的mPTP關閉顯著降低了TLR2和TLR9的相對熒光強度，即使在HR條件下也是如此；而FCCP和ATP誘導的mPTP持續開放刺激了這兩種受體的表達，但ACT不再逆轉這種作用。除TLR3外，所有TLR均通過MyD88通路傳遞信號，并激活核因子-κB (NF- κB )轉錄因子，從而加劇肝臟炎癥[ 23 ]。HIRI組和HR組中TLR9、MyD88和p-NF-κB p65的蛋白水平均顯著升高，而ACT治療可降低這些蛋白水平（圖4e；補充圖S6b ）。ACT對體外TLR2表達的降低作用不顯著。接下來，為了進一步確定哪些轉錄因子或下游基因受到NF- κB的影響，我們利用CHEA3數據庫進行預測，最終發現了IRF1（圖4f）。最近有報道稱，NF- κB p65可與Irf1啟動子區域結合，從而激活其轉錄。[ 24 ]進一步轉位至細胞核內，并作為轉錄因子激活下游基因網絡。如圖4g和補充圖S6c所示，與HR組相比，ACT顯著下調了IRF1的熒光表達和核定位。然而，在mPTP持續激活的情況下，這種ACT介導的限制性轉位效應被完全抑制（圖4h；補充圖S6d）。

圖4. ACT通過調控TLR9-MYD88-NF- κB信號通路抑制IRF1的核轉位。(a) 原代肝細胞中TLR基因表達的三維圖。(b) 小鼠肝臟和(c) AML12細胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)、HNF-4α (488 nm)、CK18 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺分別為100 μm和20 μm。(d) AML12細胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺為20 μm。小鼠肝臟和AML12細胞中TLR9、TLR2、MYD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表達水平以β-肌動蛋白進行標準化。(f) 篩選調控CMPK2基因的轉錄因子。(g)、(h) AML12細胞中IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。統計學意義：*** P < 0.001，與對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數據以平均值±標準誤表示，細胞實驗n = 3，小鼠實驗 n = 6）。

ACT通過抑制IRF1來減少CMPK2的轉錄以及隨后的mtDNA合成和釋放

為了進一步驗證ACT是否通過抑制IRF1核轉位來影響線粒體損傷相關分子模式（mito-DAMPs）相關靶點的激活，我們將HIRI+ACT組與HIRI組（黃色陰影區域）的差異表達基因（DEGs）與ENCODE（綠色陰影區域）、GTRD（藍色陰影區域）和CHIP_Atlas（粉色陰影區域）數據庫中與IRF1下游靶點相關的基因信息整合在一起（圖5a）。我們重點關注四個基因集中191個基因的交集，這些基因集主要涵蓋線粒體DNA復制、細胞氧化還原穩態和炎癥反應等領域。此外，我們還對這191個差異表達基因中的關鍵基因進行了反向預測分析，結果表明IRF1是主要的潛在轉錄因子（圖5b）。結合上述兩種預測方法，我們篩選出表達倍數變化顯著的基因進行進一步研究，包括Cmpk2、Hmgb1和Duox2。在HIRI和HR組中，Cmpk2、Hmgb1和Duox2的mRNA表達均升高，但在小鼠肝臟和肝細胞中，ACT處理均可降低這些mRNA的表達（圖5c；補充圖S7a）。IRF1能夠感知來自TLR-MyD88-TRIF通路的信號，并與CMPK2的啟動子結合，進而誘導其轉錄[ 25 ]。隨后，為了探究ACT是否通過IRF1影響CMPK2的轉錄，我們利用生物信息學預測網站JASPAR鑒定了IRF1在CMPK2上的靶位點（圖5d ）。此外，我們在AML12細胞中進行的ChIP-qPCR實驗結果證實，HR促進了肝細胞中IRF1與Cmpk2啟動子或外顯子2區域的結合，而ACT處理則顯著逆轉了這一過程（圖5e）。隨后，我們瞬時轉染靶向Cmpk2 的siRNA ，或處理純化的 CMPK2 蛋白，以驗證 CMPK2 在觸發 mtDNA 泄漏及其下游靶點后續變化中的不可或缺的作用。值得注意的是，Cmpk2的敲低與 ACT 具有協同作用，導致 mtDNA 含量降低（圖 5f；補充圖 S7b），抑制 Irf1 的核轉位（圖 5g；補充圖 S7c ），進而影響Irf1和Hmgb1的轉錄（補充圖 S7d ）。此外，重組 CMPK2 蛋白有效拮抗了 ACT 對 mtDNA-TLRs/NF- κB -IRF1 信號通路的治療作用（圖 5f）。和g；補充圖 S7b和S7c）。此外，SPR 檢測表明，ACT 能夠與 IRF1 蛋白結合（圖 5h），結合位點為：(TRP38 LYS39 HIS40 ALA41 ALA42 PRO74 LYS75 THR76 LYS78 ALA79 ARG82 MET85 ASN86 SER87 LEU88 PRO89 ILE91 GLU92 GLU93 VAL94 LYS95 GLN97 SER98 ARG99 ASN100 LYS101 SER103 SER104 ALA105 VAL106 ARG107)（圖 5i，Vina 評分 = -7.4），這可能影響 IRF1 與 CMPK2 啟動子區域的結合位置。

圖5. CMPK2抑制劑與ACT聯合用藥可協同降低線粒體DNA合成和IRF1的核轉位。(a) 原代肝細胞中IRF1潛在下游靶點的脈絡圖。(b) 主要潛在轉錄因子的預測分析。(c) AML12細胞中Cmpk2、 Hmgb1和Duox2的mRNA水平以Hprt1進行標準化。(d) CMPK2的預測轉錄序列。(e)通過ChIP分析檢測Cmpk2啟動子和外顯子上的IRF1結合位點。(f) TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、(g) IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像，分別在用ACT、siCMPK2或重組CMPK2蛋白處理的AML12細胞中進行。比例尺 = 20 μm。 （h）ACT與IRF1結合的SPR結果。（i）ACT與IRF1的分子對接結果。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與模型組相比（數據以平均值±標準誤表示， n = 3）。

抑制DUOX2或完全清除缺氧肝細胞分泌的mtDNA，可發揮與ACT類似的抗HIRI保護作用

由于DUOX2異常產生的ROS會加劇氧化應激和肝細胞損傷，我們檢測發現HR組中DUOX2和CK18的共定位增加，而ACT處理可逆轉這一現象（圖6a；補充圖S8a）。我們使用生物預測網站JASPAR分析DUOX2是否為IRF1的潛在下游靶點，并預測了其靶點結合位點（圖6b ）。此外，我們在AML12細胞中進行的ChIP-qPCR結果表明，HR促進了肝細胞中IRF1與Duox2啟動子或外顯子1區域的結合，而ACT處理顯著逆轉了這一結合（圖6c）。為了進一步證實DUOX2參與了AML12細胞中ROS的產生增加及其導致的氧化還原損傷，我們通過轉染特異性序列的siRNA沉默了Duox2基因。靶向Duox2 的siRNA導致Duox2、Cmpk2、Hmgb1和Cxcl10的 mRNA 水平相應降低（圖 6d），并且與接受 HR 處理的細胞相比，ROS 生成顯著減少（補充圖 S8b），這與 ACT 具有協同作用。正如預期的那樣，HR 損傷后，胞質中釋放的氧化型線粒體 DNA (ox-mtDNA) 水平（圖 6e；補充圖 S8c）和 IRF1 的核轉位（圖 6f；補充圖 S8d）均增加，但 siDUOX2 與 ACT 聯合給藥可顯著逆轉這些變化。接下來，我們從不同肝細胞組的培養基中提取 mtDNA，并將純化的 mtDNA 濃縮，用于進一步轉染到另一組肝細胞中。如圖 6g和6h所示，與 mtDNA-Con 組相比，mtDNA-HR 組中 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平上調，而 TLR2 的 mRNA 和蛋白水平未見上調。mtDNA-HR + ACT 可降低 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平，而 DNase I 干預則可完全阻斷 TLR2 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平的上調。此外，值得注意的是，DNase I 可拮抗 mtDNA-HR 轉染引起的 IRF1 轉錄增加和核轉位，以及隨后 CMPK2 和 DUOX2 的表達（圖 6g、i、j；補充圖 S9a和S9b）。這些結果表明，氧化型線粒體 DNA (ox-mtDNA) 的生成和自分泌釋放可能是 IRF1 的下游因子，也是最終的氧化損傷驅動力，同時也是 ACT 對抗 HIRI 保護機制的關鍵組成部分。

圖 6. DUOX2 抑制和 ACT 給藥協同降低了線粒體 DNA (mtDNA) 的生成和氧化，這對于 TLR-IRF1 通路的激活至關重要。(a) AML12 細胞中 CK18 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 免疫熒光染色的代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(b) Duox2的預測轉錄序列。(c) 通過 ChIP 分析檢測Duox2啟動子和外顯子上的 IRF1 結合位點AML12 細胞中Duox2、 Hmgb1、 Cmpk2和Cxcl10的 mRNA 水平以Hprt1進行標準化圖 (e) 和 (f) 分別展示了經siDuox2和 ACT 處理的 AML12 細胞中 TOM20 (594 nm) 和 8-OHdG (488 nm) 以及 IRF1 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g)將不同組別分離的純化 mtDNA 轉染到 AML12 細胞中，并以Hprt1進行標準化，檢測Tlr9、 Tlr2、 Myd88和Irf1的 mRNA 水平。(h) 將 AML12 細胞中 TLR9、TLR2 和 MYD88 的蛋白表達水平以β-肌動蛋白進行標準化。圖 (i) 和 (j) 分別展示了 AML12 細胞中 IRF1 (488 nm)、CMPK2 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與 HR 或 mtDNA HR組相比（數據以平均值 ± 標準誤表示， n = 3）。

ACT 與 CMPK2 結合，并促進線粒體自噬依賴性的 CMPK2 降解

為了進一步探究ACT介導CMPK2降解的具體機制，我們首先在AML12細胞中應用DARTS和CETSA實驗，發現ACT能夠提高CMPK2的熱穩定性并抑制蛋白酶對CMPK2的水解，提示ACT與CMPK2之間可能存在直接結合（圖7a和b；補充圖S10a）。分子對接的相互作用分析預測ACT與CMPK2具有很強的結合親和力（補充圖S10b）。為了進一步證實ACT與CMPK2的相互作用，我們采用SPR和MST技術，確定CMPK2是ACT的直接靶點（圖7c和d；補充圖S10和S10d）。接下來，環己酰亞胺 (CHX) 追蹤實驗表明，ACT 處理后 CMPK2 蛋白水平的降解得到促進（圖 7e；補充圖 S10e）。蛋白質穩定性主要受多種蛋白質降解途徑的影響，包括泛素-蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑。為此，我們分別用 MG132 和巴弗洛霉素 A1 (BafA1) 處理 AML12 細胞以抑制蛋白酶體和溶酶體的活性，發現 BafA1（而非 MG132）能有效導致 ACT 存在下 CMPK2 的積累（補充圖 S11a）。隨后，我們使用溶酶體特異性熒光探針 Lyso-Tracker 定量分析溶酶體的生物合成，并檢測 CTSB（組織蛋白酶 B，一種主要的溶酶體水解酶）的活性以確定溶酶體的功能。如圖7f和7g以及補充圖S11b和S11c所示，在HR條件下，ACT處理可增強Lyso-Tracker的紅色熒光強度，而BafA1可逆轉這一效應。同時，ACT促進了HR組中成熟CTSB水平的升高，但BafA1阻斷了ACT誘導的pro-CTSB向成熟CTSB的轉化。此外，我們發現HR+ACT組中CMPK2與溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）的共定位程度更高，并證實ACT促進了CMPK2與溶酶體的融合降解，而BafA1可逆轉這一過程（圖7h；補充圖S11d）。

圖7. ACT通過激活線粒體自噬 直接與CMPK2結合并誘導其降解。(a) CETSA和(b) DARTS檢測。(c) SPR結果和(d) MST分析ACT與CMPK2的結合。(e) AML12細胞CHX追蹤實驗中CMPK2的蛋白表達以β-肌動蛋白進行標準化。(f) AML12細胞中Lyso-Tracker (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12細胞中前體和成熟CTSB的蛋白表達以β-肌動蛋白進行標準化。(h)、(i) AML12細胞中CMPK2 (488 nm)、LAMP-1 (594 nm)、LC3 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 20 μm。（j）AML12 細胞線粒體的代表性透射電鏡圖像。比例尺 = 20 μm。AML12 細胞中（k）PARKIN、LC3-I、LC3-II 和（l）CMPK2 的蛋白表達量以β -ACTIN 進行標準化。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與相應對照組相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，與 HR 組相比。 $ $ $ 與 HR + ACT M + Mdivi-1 組相比， P < 0.001 （數據以平均值 ± 標準誤差表示，n = 3）。

溶酶體介導的降解過程主要包括非選擇性自噬和針對不同底物的選擇性自噬，例如P62依賴性泛素化蛋白、P62依賴性受損線粒體（稱為線粒體自噬）以及通過泛素化作用降解入侵微生物[ 26 ]。ACT給藥后LC3/CMPK2的熒光比值上調，但分別被自噬抑制劑SAR405（抑制液泡蛋白分選34）和3-MA（抑制III類磷脂酰肌醇3-激酶）抑制（圖7i；補充圖S11e）。與CHX+ACT組相比，CHX+ACT+SAR405組或3-MA組中CMPK2的水平顯著升高（補充圖S11f）。接下來，我們試圖探究是哪種自噬-溶酶體通路負責CMPK2的降解。透射電鏡（TEM）結果顯示，與HR組相比，ACT處理后的AML12細胞中形成了含有受損線粒體的自噬體（圖7j）。隨后，與HR組相比，ACT處理后PARKIN、LC3、PINK1和P62的蛋白水平顯著升高，而P62的蛋白水平則降低（圖7k；補充圖S11g）。值得注意的是，小鼠肝臟中線粒體自噬標志物如PARKIN和PINK1的蛋白表達變化趨勢與AML12細胞中的趨勢一致（補充圖S11h）。STX17、SNAP29和VAMP8構成SNARE蛋白復合物，該復合物在自噬體與溶酶體的融合過程中發揮關鍵作用。值得注意的是，與STX17和SNAP29相比，VAMP8的表達水平發生了顯著變化（補充圖S12a）。隨后，我們設計了三種不同的VAMP8小干擾RNA（siRNA）用于敲低VAMP8，并篩選出最有效的VAMP8 siRNA用于進一步的CMPK2降解實驗（補充圖S12b）。補充圖S12c顯示，敲低VAMP8抑制了ACT促進CMPK2降解的作用。此外，我們用線粒體自噬激動劑（CCCP）或抑制劑（Mdivi-1）處理AML12細胞，并在HR損傷條件下檢測ACT處理后CMPK2表達的變化。Mdivi-1處理明顯減弱了HR+ACT組中CMPK2水平的下降趨勢，而CCCP處理則加劇了這種下降趨勢（圖7l）。同時，免疫沉淀實驗證實，ACT給藥后CMPK2與P62和K63的結合均減少（補充圖S12d）。以上結果表明，ACT通過促進線粒體自噬促進肝細胞中CMPK2的降解，但不影響泛素-蛋白酶體降解途徑。

肝細胞特異性CMPK2過表達可直接抵消ACT的抗HIRI保護作用

為了進一步證實CMPK2介導的肝細胞脂質代謝損傷在缺血再灌注損傷（HIRI）中的作用，以及這種損傷是否為ACT治療所特有，我們在HIRI手術和ACT預處理前，通過尾靜脈成功注射了攜帶CMPK2并經ZsGreen熒光素標記的AAV8病毒至小鼠體內（圖8a；補充圖S13a）。肝功能指標（血清AST和ALT）以及脂質含量（血清FFA和總膽固醇[TC]）表明，肝細胞中CMPK2的過表達加劇了肝臟缺氧損傷和脂質代謝異常，即使給予ACT也無法緩解（圖8b和c；補充圖S13b）。同時，CMPK2過表達肝臟的組織學檢查和TUNEL/HNF-4α共染色顯示，存在明顯的廣泛炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死，ACT干預后這些病變有所改善（圖8d和e）。此外，注射攜帶CMPK2的AAV8病毒并接受ACT治療后，肝臟中游離脂肪酸（FFA）水平降低（圖8f）。為了進一步研究CMPK2過表達對肝臟脂質代謝的刺激作用，我們分析了不同組中氧化應激標志物（包括ROS、MDA和GSH）的變化。如圖8g；補充圖S13c和S13d所示，HIRI+AAV CMPK2組中DCFH-DA熒光染色和MDA水平均顯著升高，而GSH含量降低，ACT干預后GSH含量變化不大。值得注意的是，與HIRI + AAV CMPK2組相比，ACT抑制了mtDNA向血清中的分泌（圖8h）。這些結果表明，肝細胞中CMPK的爆發性增加直接刺激mtDNA的產生，同時影響由FFA過度氧化引起的ROS積累。此外，我們驗證了各組中參與CMPK2中心信號通路的幾個關鍵靶點的表達變化。在HIRI + AAV CMPK2組中，CMPK2、TLR9、MYD88、p-NF- κB和IRF1的表達均顯著升高，而HMGB1、TLR2、ACOT2和DUOX2的表達則無顯著變化；但在小鼠肝臟中預先給予ACT后，這些靶點的表達幾乎沒有變化（圖8i和j；補充圖S13e和S13f） 。綜上所述，雖然ACT可以直接結合并抑制肝臟中CMPK2的表達，但它無法抵抗外源性CMPK2刺激引起的不良反應以及在HIRI條件下隨之發生的脂質代謝紊亂。

圖8. 肝細胞特異性過表達CMPK2顯著阻斷了ACT對小鼠肝臟的抗HIRI作用。(a) 小鼠肝臟中ZsGreen (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(b) 不同組小鼠血清中ALT水平；(c) 不同組小鼠血清中FFA水平。(d) 使用Image J軟件對H&E染色代表性圖像進行定量分析。比例尺 = 100 μm。(e) 小鼠肝臟中TUNEL (594 nm)、HNF-4α (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。(f) 不同組小鼠肝臟中FFA水平。(g) 小鼠肝臟中ROS (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫熒光染色代表性圖像。比例尺 = 100 μm。（h）不同組別血清中線粒體DNA（mtDNA）水平。（i）小鼠肝臟中CMPK2、 Tlr9、 Myd88、 Irf1和Duox2的mRNA水平以Hprt1進行標準化。（j）小鼠肝臟中CMPK2、MYD88、p-NF- κB和IRF1的蛋白表達以β-肌動蛋白進行標準化。統計學意義：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，與假手術+AAV ev組比較。 $ $ " role="presentation"> $ $ P < 0.01， $ $ $ " role="presentation"> $ $ $ 與 HIRI + AAV CMPK2組相比， P < 0.001 （數據以平均值 ± 標準誤差表示，n = 6）。

03

展 望

我們之前的研究表明，在減輕肝缺血再灌注損傷（HIRI）的過程中，及時阻斷肝細胞的氧化還原損傷和線粒體功能障礙至關重要[ 17 ]。此外，如果肝細胞的脂毒性和死亡過程不能立即停止，將會進一步擾亂整個肝臟的代謝穩態，并引發更嚴重的炎癥級聯反應[ 27 , 28 ]。在本研究中，我們發現HIRI期間肝細胞中線粒體ACOT2的異常升高促進了乙酰輔酶A合成游離脂肪酸（FFA），進而刺激了以活性氧（ROS）增加為特征的氧化還原失衡（圖1和圖2）。對HIRI全肝組織和肝細胞測序數據的生物信息學分析表明，CMPK2表達顯著上調，且與線粒體功能障礙和疾病進展呈正相關。重要的是，在ROS刺激的氧化環境下，CMPK2進一步促進了典型損傷相關分子模式（DAMP）——線粒體DNA（mtDNA）的氧化和合成，并通過肝細胞中線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放刺激其分泌（圖3）。基于細胞的自分泌實驗證實，從氧化肝細胞中純化的mtDNA通過激活低氧化狀態肝細胞中的TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信號通路，刺激了Cmpk2和Duox2的轉錄（圖4和圖5）。從機制上講，ACT與IRF1結合，抑制其核轉位以及下游靶基因的表達和功能，特別是抑制CMPK2刺激的mtDNA合成，同時降低DUOX2產生的ROS水平，從而改善HIRI或HR引起的病理現象（圖6）。此外，圖7表明，ACT促進CMPK2的翻譯降解是通過線粒體自噬而非其他溶酶體或泛素介導的降解途徑實現的。相反，肝細胞特異性Cmpk2過表達直接抵消了ACT在體內的抗HIRI保護作用（圖8）。

脂肪酸是細胞膜的重要組成部分，也是重要的能量底物，直接影響線粒體功能的穩態。然而，脂肪酸在肝臟（尤其是肝細胞）中的積累會導致活性氧（ROS）過度產生和多種細胞死亡方式[ 29 ]。本研究發現，在缺血再灌注損傷（HIRI）期間，線粒體ACOT2（而非其他ACOT家族成員）異常升高，且與游離脂肪酸（FFA）水平呈正相關，而ACT可顯著降低FFA水平。有趣的是，在缺氧條件下，ACOT2介導的FFA積累并未增強脂肪酸β-氧化；相反，它加劇了ROS的產生（圖2）。高濃度的FFA誘導線粒體解偶聯呼吸，導致質子重入而ATP無法生成，進而抑制呼吸鏈[ 30 , 31 ]。進一步研究表明，該機制可能涉及游離脂肪酸（FFA）作為輔助因子增強腺嘌呤核苷酸轉位酶2（ACOT2）的質子通透性，從而加速線粒體呼吸的解偶聯和線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放。這會加劇線粒體活性氧（ROS）產生的紊亂，形成脂毒性-高氧化-炎癥的惡性循環[ 32 ]。給予ACT后，ACOX1的誘導和CMPK2的下調協同恢復了正常的FFA氧化和整個線粒體功能。此外，它還導致FFA生成減少，部分原因歸因于ACOT2水平的降低。然而，在HIRI下CMPK2和ACOT2靶點的損傷優先性和相互作用模式，以及潛在的藥物靶點，仍需進一步研究。

CMPK2是線粒體內氧化型mtDNA片段生成所必需的。當FEN1切割ox-mtDNA后，其片段通過線粒體通透性轉換孔（mPTP）釋放到細胞質中，激活NLRP3-cGAS-STING-IFN-γ通路并誘導炎癥[ 33 ] 。CMPK2還通過后續的ox-mtDNA-cGAS-STING信號通路直接促進NLRP3炎癥小體的激活和巨噬細胞的募集，使其成為代謝性肝病進展過程中的關鍵介質[ 14 , 34 , 35 ]。ACT可降低HIRI或HR引起的CMPK2轉錄，并減少mtDNA合成，同時伴有TOM20和8-OHdG探針共染色強度的降低（圖3）。這些結果表明，ACT抑制缺氧肝細胞中線粒體DNA（mtDNA）的合成、氧化和釋放。有趣的是，在這些條件下，ACT對IFN-γ的表達影響不大，這表明它可能影響除cGAS-STING通路以外的mtDNA其他下游通路。由于其未甲基化的CpG基序，釋放的mtDNA也被報道可激活不同的分子信號通路，例如模式識別受體。值得注意的是，這種mtDNA依賴性激活表現出一定的敏感性，對TLR9具有特異性偏好，而TLR9反過來又通過NF-κB相關通路誘導一系列炎癥反應[ 36 ] 。盡管在HIRI條件下TLR2和TLR9均上調，但ACT顯著降低了這兩種受體的表達，且對TLR9的影響更為顯著（圖4e）。此外，ACT抑制了TLR9-MYD88-NF- κB通路，降低了IRF1的核轉位及其后續的CMPK2轉錄表達以及mtDNA合成。值得注意的是，我們最近發現缺氧增強了HMGB1的釋放，HMGB1通過TLR2受體進一步增強了IRF1的核轉位和功能，并伴有巨噬細胞浸潤[ 4 ] 。本研究進一步證實了HIRI可能通過不同的DAMPs激活IRF1轉錄，以及ACT的協同抗氧化和抗炎保護作用（圖3、4、6）。更重要的是，給予ACT后，FFA過度積累、線粒體呼吸解偶聯和mPTP開放均得到逆轉，從而阻斷了mtDNA的外排-識別-攝取-激活循環，形成保護性環路。

盡管CMPK2在肝臟中的基礎表達水平相對較低，但我們觀察到在缺氧刺激下，肝細胞線粒體內的CMPK2水平顯著升高，而ACT處理后，這種升高被顯著逆轉（圖3d，下半部分）。除了影響CMPK2的轉錄外，ACT還顯著降低了CMPK2蛋白的穩定性（圖7e），但對其mRNA穩定性沒有影響（數據未顯示）。此外，ACT與MG132或BafA1聯合處理后觀察到的差異表明，ACT通過自噬-溶酶體途徑降解CMPK2，這可能解釋了其促進CMPK2與溶酶體標志物LAMP1共定位的原因（圖7h）。除了影響其他經典的自噬-溶酶體降解途徑外，ACT還激活了線粒體自噬相關蛋白的表達，特別是PARKIN、PINK1、LC3和VAMP8。值得注意的是，即使在存在ACT的情況下，使用SAR405和3-MA抑制自噬早期階段、使用mdivi-1抑制線粒體自噬或沉默肝細胞中的VAMP8，均能顯著觀察到CMPK2的積累（圖7l；補充圖S11f、S12c ）。這些結果表明，ACT特異性地促進P62依賴的CMPK2線粒體自噬降解，揭示了一種靶向降解CMPK的新機制。P62能夠將泛素化的底物（例如受損線粒體上的PARKIN）與自噬體膜連接起來，這依賴于UBA結構域內的特定翻譯后修飾[ 37 ]。然而，我們初步發現ACT不影響TBK1和ULK1（負責P62在Ser349和Ser407位點的磷酸化）的激活，也不影響TIP60的表達（負責P62在K420位點的乙酰化）（數據未顯示）。在通過SPR和MST實驗證實ACT可以與CPMK2結合后，我們還預測了潛在的特異性結合位點（GLY10、GLY11、PRO12、GLY13、ALA14、GLY15、LYS16、GLY17、THR18、HIS31、SER33、ALA34和GLY35）。 ACT 是否通過與受損線粒體中積累的 CMPK2 結合，幫助 P62 執行 PARKIN 依賴的線粒體外膜泛素化和隨后的自噬，以及這一過程是否與 CMPK2 上的特定結構域有關，值得進一步研究。

【Citation】:Luo R, Yang Y, Che X, et al. Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism[J]. Targetome, 2026, 2(2).

【貢獻】★★★★★

綜上所述，我們的研究強調了 CMPK2 驅動的異常氧化還原代謝在 HIRI 發病機制中的重要性，并突出了其作為新型治療靶點與天然生物活性化合物（如 ACT）聯合干預的潛力。

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