ICH S13指導原則關鍵考量的工業界視角：寡核苷酸治療藥物的非臨床安全性評價

寡核苷酸治療藥物（Oligonucleotide Therapeutics, ONTs）是一類成熟的藥物，具有高度特異性的藥理活性。本文所討論的ONTs包括反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾RNA（siRNA）、Antagomirs（miRNA抑制劑）、RNA編輯寡核苷酸、miRNA模擬物、小激活RNA（saRNA）。未納入討論的類型包括用于DNA編輯的(g)RNA、DNA/RNA疫苗以及編碼型mRNA，因其作用機制存在顯著差異。

ONTs通過與mRNA等分子靶點結合，調控特定致病蛋白或其變異體的表達，從而實現精準治療。盡管ONTs在全身循環中清除較快，但在靶組織中可產生持久的藥效學（PD）。這一特性使其具備“長效低頻給藥”的潛力。

由于其理化性質限制，ONTs常需局部給藥，例如：1）鞘內注射（IT）：用于中樞神經系統（CNS）疾病；2）玻璃體內注射：用于眼部疾病；3）吸入給藥：用于肺部靶向治療。若采用全身給藥（如皮下或靜脈注射），通常需借助特殊遞送技術以增強靶組織和細胞的攝取，包括：1）小分子偶聯：如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc，靶向肝細胞）；2）大分子偶聯：如轉鐵蛋白受體1（TfR1）抗體；3）脂質納米顆粒（LNP）包封。

從藥物分類與監管現狀的角度，ONTs既不屬于傳統小分子，也不完全等同于生物大分子。不過，與生物藥有些相似，作用機制高度特異、藥效持久、模擬天然生物學通路。但為化學合成，并常含化學修飾以提升穩定性、效力和持久性。

目前行業普遍依據以下ICH指南開發ONTs：ICH M3(R2)、ICH S6(R1)。然而，全球尚無專門針對ONTs的國際統一監管指南。目前主要依賴：行業實踐、企業公開的非臨床數據、跨行業工作組白皮書（如OSWG、EFPIA ONT非臨床工作組）、已獲批產品的公開審評報告。當然，日本PMDA已于2020年發布ONT專屬指南，是目前少有的區域性專門指導文件。

在此背景下，鑒于ONTs作為治療模式的日益成熟及其非臨床開發的獨特性，ICH于2024年初正式啟動新安全議題 “ICH S13——寡核苷酸治療藥物的非臨床安全性評價”：概念文件于2024年11月正式通過。同月，美國FDA也發布了相關草案指南《寡核苷酸治療藥物的非臨床安全性評估》。

為向ICH S13制定提供產業視角，國際制藥創新與質量聯盟（IQ Consortium）下屬的DruSafe ONT工作組（ONT WG）設立了專項任務組，旨在：識別ONT非臨床開發中的關鍵考量，明確最需監管協調與澄清的領域。工作組成員頻繁研討，圍繞ONT非臨床安全性評價形成共識建議。

本文基于工作組成員的豐富行業經驗、現有監管指南、科學文獻和行業白皮書，提出關于ONT非臨床安全性評價的核心建議與考量（見下圖）。本文是產業界對即將出臺的ICH S13國際指導原則的重要前期貢獻，旨在推動ONT非臨床開發的科學性、一致性與全球協調。

雜交依賴性脫靶效應分析

ONTs的一個潛在安全性風險是脫靶雜交依賴性效應，即ONT通過堿基互補配對意外結合并調控非目標轉錄本（mRNA等）。由于當前大多數ONT具有持久的藥效學作用（持續數周至數月），識別并規避具有生物學意義的脫靶效應成為非臨床安全性評價的關鍵環節。

行業共識建議（源自OSWG白皮書），關于脫靶識別與風險評估的行業推薦流程，主要包括以下四步：1）初步識別：利用生物信息學和轉錄組學方法，預測潛在的脫靶相互作用；2）聚焦相關細胞類型：僅在已證實ONT具有藥理活性的細胞類型中開展深入分析，提高相關性；3）實驗驗證與安全窗評估：在人源細胞模型中實驗驗證生信預測的脫靶效應，并建立體外脫靶活性與靶向活性之間的劑量/效應比值（即體外安全邊際）；4）風險后果評估：評估命中關鍵脫靶轉錄本可能帶來的生物學或毒性后果（如調控關鍵通路、影響細胞功能等）。

IQ DruSafe工作組建議ICH S13專家工作組：采納OSWG白皮書中的上述推薦；并明確脫靶評估應在藥物開發的哪個階段進行（例如：候選物確定前、IND申報前等），以確保科學性和可操作性。

動物活性替代分子的使用

當缺乏對候選ONT具有藥理相關性的動物種屬（即ONT在常規毒理試驗動物中無活性）時，可采用嚙齒類活性替代寡核苷酸（surrogate）開展非臨床研究。該替代分子需能靶向動物體內同源基因（ortholog），用于評估藥理作用過度放大所導致的毒性，如一般毒性或發育毒性。在生殖毒性研究中，也可作為減少非人靈長類（NHP）使用的策略。

IQ DruSafe工作組建議ICH S13明確以下要點：1）用途限定：替代分子僅應用于危害識別，不可直接外推臨床風險，因其可能存在與臨床候選物不同的脫靶譜（因序列差異導致雜交依賴性脫靶不同）；2）給藥劑量與頻率：應使用最低有效劑量和最少給藥頻次，以模擬人體預期的藥理暴露水平；避免超藥理劑量，否則可能引發物種特異性脫靶效應，與替代分子本身相關的非臨床相關毒性；3）PK/TK：若在毒理研究中已明確觀察到PD，則無需強制要求完整的PK/TK數據；4）分子設計要求：替代分子應盡可能與臨床候選ONT保持一致，包括相同的化學骨架與修飾類型（如PS、2'-MOE、GalNAc等），相近的序列長度，相同的靶向機制（如偶聯的配體/遞送部分也需具備活性）。

目標是最大化替代分子的毒理相關性，確保其能真實反映臨床候選物在人體中可能產生的藥理介導毒性。

安全藥理學

ONT WG建議：在可行情況下，將安全藥理學評估整合到一般毒理學研究中，遵循ICH S7A、S7B及ICH S6(R1)的指導原則。安全藥理學試驗應在臨床試驗啟動前完成，并參考OSWG的建議。

時間點選擇需要注意。鑒于ONT具有持久的PD，動物研究中安全藥理學評估的時間點應綜合考慮：血漿達峰時間（Tmax）、最大藥效作用時間。

關于hERG通道與心臟安全性：常規不推薦進行體外hERG抑制試驗（即使用于TQT豁免），理由包括：ONT的理化特性（大分子、帶負電、不易穿透細胞膜）；現有數據表明其心臟風險極低；與日本PMDA《寡核苷酸指南》一致。當然，也有些例外情況，可考慮開展hERG試驗。比如靶點生物學或已證實的脫靶效應可能影響hERG表達或功能，或體內遙測研究中觀察到QTc間期延長。

若進行hERG試驗，反對測定細胞內藥物濃度，原因包括：1）技術上難以區分：細胞內、膜結合、離子通道結合的藥物；2）缺乏人體心肌組織藥物濃度數據，結果難以解讀。

其他體外次要藥效學試驗：不推薦常規開展針對其他離子通道、GPCRs、轉運體或酶的體外篩選。這些方法是為小分子優化設計的，不適用于ONT。但支持在出現特定體內安全性信號后，回溯性增加相關體外機制研究。

一般毒理學

重復給藥毒理研究需重點考慮：種屬選擇、給藥途徑、劑量選擇、給藥頻率與周期、恢復期設置。

ONT通常靶向人類特異性序列，在非臨床種屬中藥理活性有限；雖常全身給藥，但局部給藥（如鞘內、玻璃體內）也很常見。其特點是：血漿清除快，但組織半衰期長、藥效持久——這要求采用不同于小分子或傳統生物藥的評估策略。

1.種屬選擇

當前行業慣例：使用嚙齒類+非嚙齒類（如猴）雙種屬，但許多ONT在嚙齒類中無藥理活性。為踐行3R原則（減少動物使用）并依據ICH S6(R1)，ONT WG建議ICH S13考慮單一種屬即可滿足要求的情形，例如：1）無藥理相關種屬且無可用藥理活性替代分子時（如外顯子跳躍型ASO），可在FIH（首次人體）或慢性毒理研究中僅用單一種屬；2）亞慢性研究未見明顯毒性，或已知的動物毒性（如PS骨架ASO在猴中引起的補體激活）對人風險評估意義有限；3）偶聯靶向配體（如單抗）：該配體僅與單一非臨床種屬交叉反應；或配體與ONT部分無共同的藥理相關種屬。

2.劑量選擇

當前實踐：行業通常結合ICH M3(R2)（小分子導向）與ICH S6(R1)（生物藥導向）制定方案。

ONT WG核心建議：高劑量選擇應優先遵循ICH S6(R1)，而非M3(R2)。原因是ONT血漿PK與組織PD脫鉤。血中快速清除，但組織暴露持久、藥效長期維持；M3(R2)基于50倍AUC安全邊際，適用于小分子，但對ONT機制上不相關（毒性由組織內作用決定，非血漿暴露），技術上不可行（遞送系統飽和，無法達到高AUC），易引發種屬特異性假象（如猴特異性補體激活），降低臨床相關性，增加不必要的動物使用。

S6(R1)推薦的高劑量設定原則，取以下兩者中較高者：1）在毒理種屬中實現最大預期藥理作用的劑量；2）達到約10倍于人體最大臨床暴露的劑量。超出此范圍的進一步加量通常不提供額外價值。

因此，S6(R1)的“~10倍/最大藥效”框架更科學、更符合3R原則。M3(R2)僅在評估化學結構特異性毒性或脫靶風險時酌情參考。

3.給藥頻率與周期

特點：臨床給藥頻率遠低于傳統藥物（如每月、每季度甚至更長）。部分ONT藥效持續≥6個月。

建議ICH S13應明確：非臨床給藥方案如何支持人體延長給藥間隔。

恢復組設置需考慮ONT的組織滯留特性：不要求在恢復期末達到“組織藥物完全清除”或“靶基因PD完全回到基線”。恢復期應足以觀察可逆性毒性（無論靶向或脫靶）的部分恢復。對于已充分表征、明確可逆的ONT類別效應（如某些肝酶升高），可豁免恢復組。

聯合毒理學研究

當兩種或多種ONTs作為復方產品共同開發時，ONT WG）建議ICH S13專家工作組（EWG）提供明確指導。

1.是否需要開展聯合毒性研究？

若臨床與非臨床數據及藥理學證據表明：聯合用藥不太可能產生相加、不可預測或協同毒性，則可考慮豁免專門的聯合毒性研究（符合ICH M3(R2)原則）。

2.若需開展聯合毒性研究，推薦方案如下：1）研究周期：90天重復給藥毒性試驗；2）種屬數量：單一種屬（需為藥理相關種屬）即可支持后期臨床試驗或上市申請。

3.其它考量因素

各ONT在毒理種屬中的藥理活性需要考慮。若某ONT在該種屬中無藥理活性，可考慮使用具有藥理活性的替代分子參與聯合研究。

劑量與給藥頻率設定依據：應基于各ONT的人體相關劑量與暴露水平，并結合其在動物模型中的藥理反應強度。目標是確保聯合毒性研究能真實反映臨床聯合用藥的潛在風險，同時避免不必要的動物使用。

遺傳毒性評估

基于EFPIA寡核苷酸非臨床工作組的行業調研及其他研究（共涵蓋多種ONT類別與化學修飾）：核心遺傳毒性試驗組合（如Ames、染色體畸變、微核試驗）中未見陽性結果。

ONT不與DNA直接反應，迄今測試的各類化學修飾均未顯示致突變性或染色體斷裂作用。

理論上，若ONT的靶基因或脫靶mRNA參與DNA修復或細胞周期調控，可能間接影響基因組穩定性。但此類風險通常可通過靶點生物學評估和脫靶選擇性分析予以識別和控制。

ONT WG具體建議：1）常規情況下可豁免遺傳毒性試驗：所用化學修飾已有充分遺傳毒性數據支持其安全性。無證據表明其靶點或潛在脫靶機制具有遺傳毒性風險。此時，應基于已有知識進行風險評估，無需開展體外或體內遺傳毒性試驗；2）使用新型化學修飾時：應按照ICH S2(R1)要求，進行標準遺傳毒性試驗組合以表征風險。上述建議與既往其他行業組織（如OSWG）的共識一致。

鑒于ONT遺傳毒性風險極低，若確需開展體內試驗，建議：將骨髓微核試驗整合到重復給藥毒性研究中，而非單獨進行。無需每日給藥，因ONT具有長組織半衰期，采用重復給藥研究中的實際給藥方案進行微核評估在科學上是合理的。

關于劑量考量與監管指導需求。重復給藥毒性研究中的劑量通常達不到ICH S2(R1)規定的遺傳毒性試驗限值，且許多ONT在骨髓中的分布有限（相比肝、腎等器官）。因此，ICH S13應明確可接受的體內遺傳毒性試驗劑量標準，避免因劑量不足導致假陰性結論。

發育與生殖毒性

2023年，健康與環境科學研究所（HESI）DART委員會舉辦ONT專題研討會，達成廣泛共識：性成熟猴應作為DART評估的最后選擇（即“最后手段”），以減少NHP使用。此觀點與既往行業建議及ONT WG立場一致。

胚胎-胎仔發育研究（EFD）推薦采用兩種種屬：嚙齒類+兔。依據ICH S5(R3)，僅需在其中一種種屬中具備藥理活性即可。若候選ONT在嚙齒類和兔中均無藥理活性，則應使用具有藥理活性的替代分子與臨床候選物一同開展一項或多項DART研究；或考慮使用表達人源靶點的轉基因嚙齒模型。若既無可用藥理活性種屬，又無法合理使用替代分子，仍應按要求在兩個種屬中進行EFD研究（即使無藥理活性），以滿足監管基本要求。

關于劑量設計建議：與一般毒理學一致，DART研究中的劑量水平與給藥頻率應能支持擬議的臨床給藥方案，ICH S13應對此提供明確指導。

致癌性評估

目前數據表明，ONTs的遺傳毒性和致癌性風險極低。建議遵循現有ICH指南：ICH M3(R2)、ICH S1A/S1B(R1)。

推薦采用“證據權重法”（WoE）。特別適用于在大鼠/小鼠中無藥理活性的ONT。不鼓勵使用嚙齒類替代分子進行致癌性研究，理由同ICH S6(R1)對生物藥的規定：同源產品在致癌性研究中價值有限。

即使開展致癌性研究，也無法完全排除靶點相關的致癌風險（如長期抑制抑癌通路）。因此，優先采用WoE綜合評估（整合靶點生物學、臨床前/臨床數據、機制信息等），而非強制追加使用種屬特異性替代ONT的額外研究。

若必須使用替代ONT進行致癌性研究，應僅用于危害識別。研究設計需盡量避免脫靶效應干擾（如替代分子特有的基因調控），確保結果與人體候選物相關。

當已有研究發現以下嚙齒類特異性腫瘤信號時，可認為與人無關，接受WoE結論：注射部位相關腫瘤、小鼠血管肉瘤、由慢性肝細胞損傷引起的肝腫瘤（若臨床未觀察到類似肝毒性）。

免疫毒性與血液學效應

ONT可能通過以下途徑引發免疫反應。

補體激活：PS修飾的ONT（尤其是ASO）可抑制補體因子H，激活旁路補體通路。人源因子H的抑制能力約為NHP的3倍→NHP可能高估人體補體激活風險。此為某類ONT的類別效應，但具有一定序列依賴性。

Toll樣受體（TLR）：可誘導促炎細胞因子釋放。免疫刺激潛力同樣具有序列特異性。

當前ONT設計通常規避免疫刺激基序，并引入化學修飾以降低風險。因此，無需常規開展廣泛的體外/體內免疫毒性篩查。

ONT WG建議：免疫毒性評估應聚焦于特定風險（如ONT類型、化學骨架、已知機制），避免“一刀切”式測試。

血液學效應：血小板減少與凝血異常。PS骨架ASO在臨床前和臨床中偶見血小板減少、凝血參數改變（如PT、aPTT、纖維蛋白原）。機制尚不明確，可能涉及免疫性或非免疫性途徑。NHP毒理研究中應常規監測血小板計數、纖維蛋白原、PT、aPTT等。免疫介導的血小板減少因發生率低，通常需在后期臨床試驗中確認。不推薦默認開展體外免疫毒性或凝血機制試驗，僅在出現相關信號時（如動物或早期臨床數據提示風險）按需進行——與FDA 2024年草案指南一致。

抗藥抗體（ADA）：ONT WG建議ICH S13明確，在重復給藥毒理研究中何時需檢測ADA。ADA檢測應觸發條件包括TK特征顯著改變；PD反應異常；出現無法解釋的毒性。為便于評估，建議前瞻性采集并儲存血清樣本。

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