做抗體研發(fā)必看！CHO 細(xì)胞代謝調(diào)控讓 IgA 產(chǎn)量翻倍

摘要:我這次跟著團(tuán)隊(duì)做了個(gè)關(guān)于IgA抗體生產(chǎn)的研究，核心是看hNGF、hEGF等生長因子，搭配琥珀酸、硫酸鋅這些補(bǔ)料，對產(chǎn)IgA的CHO細(xì)胞代謝和產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hNGF+hEGF搭配琥珀酸的組合，能顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)中的乳酸、銨離子等代謝副產(chǎn)物，還能提升細(xì)胞密度，對IgA2m1亞型的提升效果尤其明顯。CHO細(xì)胞的代謝調(diào)控，真的是優(yōu)化重組IgA抗體生產(chǎn)的關(guān)鍵抓手。

一、為啥要做IgA抗體的生產(chǎn)優(yōu)化？

當(dāng)下生物藥研發(fā)里，IgG抗體的研究和生產(chǎn)已經(jīng)很成熟了，但IgA抗體的潛力其實(shí)被低估了。IgA在黏膜免疫里的作用很關(guān)鍵，對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果也比IgG更有優(yōu)勢，是新一代腫瘤免疫治療的好苗子。CHO細(xì)胞是重組抗體生產(chǎn)的主流宿主細(xì)胞，不過血清無血清培養(yǎng)的要求，讓培養(yǎng)基配方成了生產(chǎn)的核心問題。IgA的糖基化過程比IgG復(fù)雜，代謝副產(chǎn)物還會(huì)影響其質(zhì)量和產(chǎn)量，這也是我們研究的初衷。

二、實(shí)驗(yàn)用了哪些方法？

這次實(shí)驗(yàn)選的是產(chǎn)IgA1和IgA2m1的CHO DG44穩(wěn)定細(xì)胞系，用IMDM和DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。我們在培養(yǎng)基里加了hNGF、hEGF、FGF-b三種生長因子，還搭配了琥珀酸（谷氨酰胺替代物）、硫酸鋅這些補(bǔ)料，設(shè)置了不同的濃度梯度。用臺(tái)盼藍(lán)染色法測細(xì)胞密度和活力，靠ELISA測抗體產(chǎn)量，還通過試劑盒檢測了培養(yǎng)基中的葡萄糖、乳酸、銨離子和LDH活性，全程用靜態(tài)培養(yǎng)的方式做觀察。

三、單一生長因子，對CHO細(xì)胞的影響有差異

往培養(yǎng)基里加12.5ng/ml的生長因子后，產(chǎn)IgA1和IgA2m1的CHO細(xì)胞密度，比空白對照組高了1.4-2.9倍。hNGF的效果是最明顯的，培養(yǎng)第10天，IgA1細(xì)胞系密度到了9.0×10?cell/mL，IgA2m1更是到了1.0×10?cell/mL，比hEGF和FGF-b的效果強(qiáng)很多。FGF-b的表現(xiàn)卻不盡如人意，第10天的細(xì)胞密度和活力，比hNGF組幾乎降了一半，對IgA1細(xì)胞系的抑制更明顯。

圖1 三羧酸循環(huán)（TCA cycle）與糖酵解代謝途徑

圖2 生長因子補(bǔ)料對IgA1、IgA2m1細(xì)胞系濃度（A、B）和活力（C、D）的影響

四、生長因子+硫酸鋅，讓葡萄糖消耗更合理

高葡萄糖濃度會(huì)提升抗體產(chǎn)量，但也會(huì)抑制細(xì)胞生長，還會(huì)增加代謝副產(chǎn)物。單獨(dú)加生長因子時(shí)，IgA1和IgA2m1細(xì)胞系的葡萄糖消耗速率相差不大。而生長因子+硫酸鋅的組合，能讓葡萄糖消耗降低約45%，其中hNGF+硫酸鋅的效果最好，培養(yǎng)基中殘留葡萄糖濃度，IgA1組高1.3倍，IgA2m1組高1.46倍，IgA2m1組的殘留葡萄糖甚至達(dá)到了287μM。

圖3 生長因子對產(chǎn)IgA1、IgA2m1穩(wěn)定細(xì)胞系葡萄糖消耗的影響

五、代謝副產(chǎn)物減少，抗體產(chǎn)量才會(huì)漲

乳酸和銨離子是CHO細(xì)胞培養(yǎng)的主要有毒代謝副產(chǎn)物，會(huì)抑制細(xì)胞生長還會(huì)影響抗體糖基化。FGF-b會(huì)讓乳酸和銨離子的產(chǎn)量大幅上升，而hNGF和hEGF能讓LDH活性降低1.5-3.5倍，銨離子水平也顯著下降。IgA2m1細(xì)胞系在hNGF+硫酸鋅的組合下，銨離子濃度只有0.45nmol，比IgA1組低了3.33倍。代謝副產(chǎn)物的減少，直接帶動(dòng)了抗體產(chǎn)量，IgA2m1組的產(chǎn)量比FGF-b組高了2倍。

圖4 FGF-b、hNGF、hEGF對靜態(tài)培養(yǎng)10天的IgA1、IgA2m1細(xì)胞系代謝物水平和產(chǎn)量的影響

六、琥珀酸+生長因子，成IgA2m1高產(chǎn)的關(guān)鍵

把谷氨酰胺替換成4mM的琥珀酸，再搭配hNGF或hEGF，對CHO細(xì)胞的代謝優(yōu)化效果更明顯。琥珀酸能參與TCA循環(huán)，在谷氨酰胺濃度低時(shí)，成為細(xì)胞的重要碳源。培養(yǎng)第10天，IgA2m1細(xì)胞系的產(chǎn)量提升了25%，當(dāng)生長因子濃度提升到25ng/ml時(shí)，乳酸產(chǎn)量進(jìn)一步降低，IgA2m1的產(chǎn)量最高達(dá)到了0.487mg/mL。而IgA1細(xì)胞系的產(chǎn)量，卻只有IgA2m1的1/2左右，這個(gè)亞型的代謝調(diào)控，還需要更多探索。

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)料組合對IgA1、IgA2m1細(xì)胞系代謝和產(chǎn)量的影響

七、這次研究，給抗體生產(chǎn)帶來的實(shí)際啟發(fā)

其實(shí)這次實(shí)驗(yàn)最直觀的感受，就是CHO細(xì)胞的代謝和抗體產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)，比想象中更緊密。琥珀酸替代谷氨酰胺，能直接減少乳酸的生成，而hNGF和hEGF不僅能提升細(xì)胞密度和活力，還能讓細(xì)胞更高效地利用營養(yǎng)，甚至可能讓細(xì)胞從產(chǎn)乳酸切換到消耗乳酸的狀態(tài)。FGF-b在這次實(shí)驗(yàn)里的表現(xiàn)拉胯，大概率是因?yàn)樗^度刺激了細(xì)胞增殖，反而讓代謝紊亂，副產(chǎn)物堆積。

對于工業(yè)生產(chǎn)來說，hNGF+hEGF+4mM琥珀酸的培養(yǎng)基配方，能直接用于產(chǎn)IgA2m1的CHO細(xì)胞培養(yǎng)，高細(xì)胞密度加上低代謝副產(chǎn)物，不管是批次培養(yǎng)還是流加培養(yǎng)，都能提升生產(chǎn)效率。而IgA1細(xì)胞系的優(yōu)化，還需要調(diào)整補(bǔ)料的濃度和組合，找到適合它的代謝調(diào)控方式。

某種程度上，重組IgA抗體的生產(chǎn)優(yōu)化，核心就是找到能平衡細(xì)胞生長、營養(yǎng)消耗和代謝副產(chǎn)物的培養(yǎng)基配方。這次的研究只是一個(gè)切入點(diǎn)，后續(xù)還能探索更多生長因子和補(bǔ)料的組合，甚至結(jié)合代謝工程改造CHO細(xì)胞，讓IgA抗體的生產(chǎn)更高效、更穩(wěn)定。

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