淺談干細(xì)胞產(chǎn)品的臨床前藥理毒理研究

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始未分化細(xì)胞，它們?cè)谌梭w中扮演著重要的角色。干細(xì)胞能夠分化成多種類型的細(xì)胞，包括但不限于血液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等具備替代和修復(fù)死亡和受損傷的細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞等作用，并可通過旁分泌作用，分泌多種生物活性因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。干細(xì)胞的這些功能使其在醫(yī)學(xué)研究和治療中具有巨大的潛力，特別是在組織修復(fù)、再生醫(yī)學(xué)和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域。簡(jiǎn)單總結(jié)下干細(xì)胞的作用，就是“4R”，即repair（修復(fù)）、replace（取代）、restore（恢復(fù)）、regenerate（再生）。

目前用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的干細(xì)胞主要有4種：1）人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells, hESCs）；2）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）；3）成體干細(xì)胞（adult stem cells, ASCs）又稱組織特異性干細(xì)胞或成體多能干細(xì)胞；4）基因編輯干細(xì)胞（gene-editing stem cells, GSCs）。hESCs是一種具有極高分化潛能的細(xì)胞，它們來源于早期胚胎（通常是受精卵發(fā)育到囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）。hESCs具有發(fā)育全能性，理論上可以分化為成人體內(nèi)的任何一種細(xì)胞類型。iPSCs是一種通過特定方法將成熟體細(xì)胞重新編程為具有多能性狀態(tài)的干細(xì)胞。通過向成熟體細(xì)胞（如皮膚細(xì)胞或血液細(xì)胞）中引入特定的轉(zhuǎn)錄因子（如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc），可以將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs。iPSCs具有與胚胎干細(xì)胞類似的多能性，能夠分化成體內(nèi)幾乎所有類型的細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比，iPSCs的獲取不涉及破壞胚胎，因此在倫理上更具優(yōu)勢(shì)。ASCs存在于成熟動(dòng)物的許多組織中，負(fù)責(zé)維持和修復(fù)組織。通常與它們所在的組織或器官具有相同的特性，例如，造血干細(xì)胞主要存在于骨髓中，負(fù)責(zé)生成血細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞的分化潛能通常有限。它們主要分化為所在組織的特定細(xì)胞類型，但某些成體干細(xì)胞也顯示出跨系分化的潛力。GSCs是指利用基因編輯技術(shù)對(duì)干細(xì)胞的基因組進(jìn)行精確修改的細(xì)胞。這種技術(shù)允許科學(xué)家在分子水平上改變或修復(fù)特定基因，以研究基因功能、治療遺傳性疾病或提高干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。

干細(xì)胞因其可自我更新、多向分化及旁分泌影響其它細(xì)胞群等特點(diǎn)，為非臨床研究帶來了很多挑戰(zhàn)，結(jié)合公開文獻(xiàn)和指導(dǎo)原則做下梳理。

干細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床評(píng)價(jià)需要回答以下幾個(gè)核心問題。用于動(dòng)物試驗(yàn)的干細(xì)胞，要進(jìn)行充分的表征，包括但不限于細(xì)胞鑒定、純度、活力、無菌和穩(wěn)定性等。之后再通過動(dòng)物模型、生物分布、毒理和成瘤性試驗(yàn)逐步表征干細(xì)胞的藥理學(xué)和毒理學(xué)特點(diǎn)。

之所以要回答以上問題，很大程度上與干細(xì)胞這類產(chǎn)品的特點(diǎn)相關(guān)。所有的安全性風(fēng)險(xiǎn)來自于干細(xì)胞的增殖和分化特性。增殖和分化均有成瘤風(fēng)險(xiǎn)。一是有些增殖不可控，可能成瘤。二是有些非預(yù)期的分化會(huì)形成異位組織。最終分化的細(xì)胞（intended cell type）可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)育成熟后通過多種作用機(jī)制發(fā)揮作用，需要研究清楚。干細(xì)胞也有可能移行到遠(yuǎn)端組織，引起毒性。另外一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)則是免疫原性，風(fēng)險(xiǎn)可能來自干細(xì)胞本身，也可能來自基因修飾的表達(dá)產(chǎn)物，涉及到免疫系統(tǒng)對(duì)受試干細(xì)胞的反應(yīng)。非臨床安全性研究很大程度上就為了評(píng)估這些風(fēng)險(xiǎn)。

GLP依從性

原則上非臨床安評(píng)應(yīng)遵循GLP。如果是藥效或生物分布中伴隨安全性終點(diǎn)，也應(yīng)最大限度按照GLP要求執(zhí)行。

相關(guān)種屬選擇

首先，干細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究沒有默認(rèn)種屬，能提供所選擇種屬的科學(xué)依據(jù)即可。所選擇的種屬需是藥理學(xué)敏感種屬，即動(dòng)物對(duì)人源干細(xì)胞及其分化后細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)與預(yù)期人體反應(yīng)類似。為滿足常規(guī)研究周期需要，動(dòng)物要有3-12個(gè)月正常壽命。另外，動(dòng)物試驗(yàn)系統(tǒng)需要是“progressive host”，允許細(xì)胞正常生存。FDA建議先在目標(biāo)種屬上開展預(yù)試驗(yàn)，看下接種細(xì)胞的生存情況。尤其擬采用免疫健全動(dòng)物開展實(shí)驗(yàn)，如果免疫排斥明顯，細(xì)胞不能正常長(zhǎng)期存活，不適合在該種屬開展正式毒理研究。

另外，所選動(dòng)物盡量能滿足相同的臨床擬用裝置和給藥路徑。大鼠（包括新生動(dòng)物）、小鼠、非人靈長(zhǎng)類、豬、手術(shù)動(dòng)物、免疫缺陷動(dòng)物模型等均有使用經(jīng)驗(yàn)。大、小動(dòng)物各有優(yōu)劣，說不上誰好誰壞，大動(dòng)物生理學(xué)和解剖結(jié)構(gòu)與人體更為接近，方便采用臨床擬用裝置將藥物遞送到理想位置，并能保障充分的遞送劑量。小動(dòng)物則數(shù)量可以更多、更容易進(jìn)行基因編輯，且有大量現(xiàn)成的免疫缺陷動(dòng)物可用。

相比于健康動(dòng)物，免疫缺陷動(dòng)物潛在可減少免疫排斥，即免疫耐受性表現(xiàn)更好。免疫缺陷動(dòng)物可以是先天缺陷，也可以給予免疫健全動(dòng)物免疫抑制藥物實(shí)現(xiàn)。免疫缺陷和免疫抑制動(dòng)物模型也是各有優(yōu)劣，如下表所示。

動(dòng)物疾病模型有助于活性-毒性和風(fēng)險(xiǎn)-獲益比的評(píng)估，也是推薦采用的。但動(dòng)物疾病模型也是有優(yōu)缺點(diǎn)的。優(yōu)點(diǎn)包括：1）可以在病理生理狀態(tài)下的局部微環(huán)境中評(píng)價(jià)產(chǎn)品的安全性；2）可以同時(shí)評(píng)估劑量/活性和劑量/毒性關(guān)系；3）鑒定潛在可用于指導(dǎo)臨床的有效性和風(fēng)險(xiǎn)因素的biomarkers。缺點(diǎn)則包括：1）個(gè)體間變異大；2）缺乏可靠的歷史背景數(shù)據(jù)和基線數(shù)據(jù)；3）潛在需要給予免疫抑制劑；4）動(dòng)物護(hù)理問題和動(dòng)物倫理問題。

其它因素如解剖學(xué)角度的器官和組織大小，是否允許使用靶向遞送裝置完成人體劑量遞送，自體細(xì)胞的可獲得性等也需要在種屬選擇過程中予以考慮。比如，用于人眼的RPE干細(xì)胞植入物體積較大，因此與人類眼睛大小相似的動(dòng)物（如豬），是最合適的動(dòng)物模型。

如果對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行了基因修飾，則被改造目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的種屬相關(guān)性也需要考慮。

供試品

首選的自然是臨床擬用產(chǎn)品。可以在免疫缺陷動(dòng)物或者免疫抑制動(dòng)物中開展。還有些干細(xì)胞在免疫健全動(dòng)物中也可以開展非臨床研究，因?yàn)橛行┙臃N位置是免疫豁免的（Immune privileged），或者有些細(xì)胞具備免疫豁免特點(diǎn)，不會(huì)被動(dòng)物免疫系統(tǒng)排斥。

如果無法采用臨床擬用產(chǎn)品，也可以考慮動(dòng)物源替代產(chǎn)品，但要求比較高，無論生產(chǎn)工藝還是影響有效性和安全性的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)，均需要與人源產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)。動(dòng)物源產(chǎn)品的挑戰(zhàn)包括可能產(chǎn)生與人源干細(xì)胞不同的生物學(xué)作用、缺少表征動(dòng)物源干細(xì)胞的試劑、潛在產(chǎn)生不同的雜質(zhì)。而且，不同種屬間來源的干細(xì)胞之間的相似性研究尚不充分，缺乏統(tǒng)一的相似性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。這類產(chǎn)品獲得的數(shù)據(jù)，臨床轉(zhuǎn)化存在一定的不確定性。

另外，干細(xì)胞的包材和生物支持性材料的選擇和表征，也很關(guān)鍵。

藥理學(xué)研究

與其它傳統(tǒng)藥物藥理學(xué)研究邏輯類似，也是分為體內(nèi)和體外兩部分，體外重點(diǎn)考察干細(xì)胞的表型和功能，如增殖、分化、分泌等能力，以及可能的基因改造引入的功能變化。比如有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的干細(xì)胞需考察對(duì)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用和/或分化成神經(jīng)元的能力。對(duì)于潛在血管生成活性的內(nèi)皮細(xì)胞，則要考察誘導(dǎo)產(chǎn)生血管結(jié)構(gòu)的能力。體內(nèi)則需要論證模型構(gòu)建的科學(xué)性和合理性，并盡可能選擇人體疾病相關(guān)動(dòng)物模型開展。

藥代動(dòng)力學(xué)

在相關(guān)動(dòng)物種屬中考察干細(xì)胞藥代行為，如生物分布、遷移、定植、增殖、分化、存續(xù)性等。生物分布可伴隨藥效學(xué)試驗(yàn)中考察。如果涉及基因修飾，對(duì)目的基因的存續(xù)、表達(dá)等也需要研究。

安全藥理學(xué)

可結(jié)合在一般毒理學(xué)研究中進(jìn)行。是否需要開展補(bǔ)充和追加的安全藥理學(xué)研究，則視產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)和情況而定，與其它藥物的開展原則類似。

一般毒理學(xué)

種屬

相關(guān)種屬選擇依據(jù)前文已有介紹。毒理試驗(yàn)原則上采用兩種動(dòng)物開展。如采用一種動(dòng)物，需要提供科學(xué)合理性依據(jù)。通常采用雙性別動(dòng)物開展，如采用單一性別，也需要說明合理性。

劑量設(shè)計(jì)

同其他類型藥物，一般設(shè)置多個(gè)劑量，如低、中、高三個(gè)劑量。高劑量可以藥效學(xué)最高劑量的一定倍數(shù)、臨床最高劑量的一定倍數(shù)或最大可行劑量。低和中劑量則在高劑量基礎(chǔ)上設(shè)置合理劑間距確定。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物給藥場(chǎng)景盡可能模擬臨床，與臨床用藥場(chǎng)景盡可能接近（Mimic clinical scenario as closely as possible），包括細(xì)胞活力、濃度、制劑、體積、遞送速率、植入或注射部位、植入或注射數(shù)量、遞送系統(tǒng)、遞送時(shí)間節(jié)點(diǎn)、遞送方案、給藥途徑等。除了給藥組和陰性對(duì)照組，可根據(jù)情況設(shè)置假手術(shù)組。

試驗(yàn)周期的長(zhǎng)度取決于干細(xì)胞產(chǎn)品的體內(nèi)存續(xù)時(shí)間和受試動(dòng)物的壽命，短則4-12周，長(zhǎng)則3-12個(gè)月。根據(jù)干細(xì)胞作用時(shí)間長(zhǎng)短和給藥次數(shù)，動(dòng)物處理時(shí)間點(diǎn)一般設(shè)置為多點(diǎn)，可以分為時(shí)間點(diǎn)1（給藥后48h或1周）、時(shí)間2（給藥后2周或3個(gè)月）、時(shí)間點(diǎn)3（給藥后3-4周或6個(gè)月）。

生物分布和毒理學(xué)方案簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)如下表所示。有效性研究可以合并到毒理試驗(yàn)中。

Q-PCR可以用于非靶組織分布的初篩，以減少IHC技術(shù)篩選非靶組織的需求。Q-PCR陽性的組織，可以再用IHC或者其它技術(shù)確認(rèn)。通常干細(xì)胞毒理試驗(yàn)會(huì)設(shè)置多個(gè)動(dòng)物處死時(shí)間點(diǎn)，考察急性、慢性和/或延遲毒性，及可能的毒性恢復(fù)情況。前序時(shí)間點(diǎn)，Q-PCR檢測(cè)陰性，有助于減少后續(xù)時(shí)間點(diǎn)待檢組織數(shù)量。如果對(duì)照組沒有注射細(xì)胞，可以適當(dāng)調(diào)整對(duì)照組組織收集的清單，僅采集必要組織。

檢測(cè)方法

干細(xì)胞生物學(xué)作用比較復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)方法的要求很高。無論在人體還是動(dòng)物模型中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)移植后干細(xì)胞的大量死亡，成功分化的數(shù)量比較有限。傳統(tǒng)的病理HE染色可以檢測(cè)到組織內(nèi)數(shù)量比較多的干細(xì)胞，如果數(shù)量很少，HE就不那么適用了。這種情況下，需要對(duì)干細(xì)胞的作用機(jī)理有深入了解，干細(xì)胞發(fā)揮功能是通過直接發(fā)揮作用如組織再生，還是通過激活內(nèi)源性干細(xì)胞或祖細(xì)胞發(fā)揮作用。可以通過一些biomarkers，采用諸如IHC、PCR、ISH的方法進(jìn)行特異性評(píng)估。比如人源干細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)，可以通過檢測(cè)人核抗原、線粒體抗原監(jiān)測(cè)人源成分。細(xì)胞增殖則可以通過增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）或Ki67進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)胞支架

干細(xì)胞的制劑處方與傳統(tǒng)生物藥物也不同，為維持干細(xì)胞再生能力，制劑中通常會(huì)加入3D可生物降解支架、“支持性細(xì)胞”和/或其他生物活性分子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）。多細(xì)胞混合組分使得安評(píng)更加復(fù)雜化，比如移植物抗宿主反應(yīng)、支架材料的生物相容性、免疫原性等，需要重點(diǎn)關(guān)注。

試驗(yàn)終點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)的安全性終點(diǎn)包括死亡率、臨床觀察、體重、體格檢查、攝食量、飲水、臨床病理（血生化、血液學(xué)、凝血、尿液分析）、器官重量、大體解剖和組織病理學(xué)檢查等。基本與其它藥物一般毒理學(xué)研究終點(diǎn)類似。

不過，干細(xì)胞由于不能被完全清除，一般不需要設(shè)置恢復(fù)期動(dòng)物，但需要觀察足夠長(zhǎng)時(shí)間，以評(píng)估慢性和脫靶毒性。

組織收集

與傳統(tǒng)生物藥物不同，病理學(xué)家在干細(xì)胞毒理評(píng)價(jià)中的作用尤為關(guān)鍵，不僅限于干細(xì)胞可能引起的毒理學(xué)變化，還可以通過評(píng)價(jià)干細(xì)胞形態(tài)、干細(xì)胞特定的表面抗原或可用于鑒別該細(xì)胞的biomarkers等，確定干細(xì)胞的組織分布、存續(xù)時(shí)間等。

干細(xì)胞給藥部位（route of administration, ROA）和附近的引流淋巴結(jié)與藥效和安全性最相關(guān)。其次則是與給藥部位直接相連接的組織。另外，血供最豐富的器官如肝臟、脾臟和肺也需要重點(diǎn)評(píng)價(jià)，可以評(píng)估干細(xì)胞隨血液的移行擴(kuò)散。再就是一些非正常的瘤塊可能與干細(xì)胞的成瘤性相關(guān)。所以干細(xì)胞的組織病理評(píng)價(jià)可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分級(jí)，如下表示例。

成瘤性和致瘤性

未分化的干細(xì)胞有增殖上調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)，可以分化或去分化成畸胎瘤或其它腫瘤，故成瘤性是干細(xì)胞產(chǎn)品的一個(gè)重要安全性風(fēng)險(xiǎn)。最好找到合適的biomarkers界定腫瘤是否來自人源干細(xì)胞。多能干細(xì)胞（如iPSCs和ESCs）的成瘤風(fēng)險(xiǎn)高于成體干細(xì)胞（如間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等）。

致瘤性風(fēng)險(xiǎn)指干細(xì)胞終產(chǎn)品促使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的可能性。

對(duì)于成瘤性和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較低的成體干細(xì)胞產(chǎn)品，通常應(yīng)在首次臨床試驗(yàn)前至少完成體外成瘤性評(píng)價(jià)；對(duì)于擬用于非晚期腫瘤適應(yīng)癥且風(fēng)險(xiǎn)較低的干細(xì)胞產(chǎn)品，通常在上市前完成體內(nèi)成瘤性和/或致瘤性試驗(yàn)。

對(duì)于成瘤性和/或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較高的干細(xì)胞產(chǎn)品（例如多能干細(xì)胞產(chǎn)品、其他分化程度較低的干細(xì)胞產(chǎn)品、藥學(xué)和/或已有非臨床研究提示風(fēng)險(xiǎn)較高的產(chǎn)品等），在首次臨床試驗(yàn)前，應(yīng)完成體外成瘤性評(píng)價(jià)、臨床給藥途徑或敏感給藥途徑（如皮下注射、睪丸注射、肌腱注射、脊髓內(nèi)注射等，應(yīng)有合理依據(jù)）的體內(nèi)成瘤性試驗(yàn)；若成瘤性試驗(yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，或者一般毒理學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)受者來源的癌前病變、可疑癌變等，首次臨床試驗(yàn)前還應(yīng)完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗(yàn)。若成瘤性試驗(yàn)結(jié)果為陰性，上市前完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗(yàn)。

遺傳毒性

不需要開展標(biāo)準(zhǔn)組合的遺傳毒性試驗(yàn)。如果設(shè)計(jì)基因修飾，需進(jìn)行基因插入突變、基因編輯脫靶等風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

免疫原性和免疫毒性、生殖毒性、制劑安全性

與其它藥物類似，常規(guī)開展。免疫原性要考慮到動(dòng)物是免疫缺陷動(dòng)物還是免疫健全動(dòng)物，根據(jù)產(chǎn)品特性和風(fēng)險(xiǎn)，考慮是否開展。如果涉及基因修飾，表達(dá)的目標(biāo)蛋白的免疫原性也需要評(píng)價(jià)。

其它

FDA認(rèn)為，干細(xì)胞試驗(yàn)可以考慮將POC+Tox+cell fate整合在一個(gè)動(dòng)物模型中開展，更符合動(dòng)物“3R”原則。Cell fate指的是細(xì)胞的存活、分化/表型、去分化、遷移、異位組織形成、增殖等變化。