詳解生物藥物的免疫原性（ADA形成過程、風險因素、風險測定、如果降低風險、對ADME影響、ADA檢測等）

包括抗體在內的治療性蛋白已經在多個治療領域取得突破，成為主要治療選擇之一。然而，機體產生的各種“負面”的免疫反應是開發蛋白藥物的挑戰之一，包括抗藥抗體（ADA）、免疫相關輸注反應、過敏、細胞因子釋放綜合征（CRS）等。其中，ADA是評估免疫原性的主要指標。ADA既可以通過阻斷作用位點，直接中和蛋白藥物的藥效，也可以通過加速藥物清除間接影響藥效。輝瑞開發的PCSK9抗體bococizumab就因為在多個Ⅲ期臨床研究中發現了高比例的ADA，并影響藥效，最終停止開發。除了有效性，ADA對安全性也是個隱患。比如嚴重輸血依賴性腎功能衰竭患者，皮下注射重組促紅細胞生成素治療，可能會引發貧血，就與產生的中和抗體相關。

當然，并不是ADA發生率高，就一定會影響藥物成藥，需要衡量臨床的獲益-風險比。例如，抗TNFα抗體阿達木單抗是一種臨床成功的藥物，已獲得至少九種不同慢性炎癥適應證的批準。此外，阿達木單抗位列有史以來最暢銷治療藥物之一，蟬聯全球藥王好多年，其峰值年銷售額超過200億美元。然而，雖然不同數據有些出入，阿達木單抗的ADA發生率在3% -61%之間。甚至有些研究顯示，高水平的ADA會影響阿達木單抗的暴露量并降低治療效果。

阿達木的案例并不意味著沒有臨床后果，就可以默認高濃度ADA存在。畢竟ADA對安全性和有效性的風險是客觀存在的，如果在臨床階段將ADA研究透徹，以確定ADA與療效、藥代動力學或安全性之間是否存在相關性，需要進行大樣本評估，費用和時間成本都很高。輝瑞的PCSK9抗體就是個很好的例子，項目推進到Ⅲ期階段再折戟的代價太高。最好還是從源頭控制蛋白藥物的ADA風險。本文圍繞蛋白藥物的免疫原性這一主題展開討論。之前寫過一篇類似主題，，本文作了進一步補充和完善。

ADA的形成

ADA的產生是一個涉及多步驟的復雜過程，先天免疫系統和適應性免疫系統均參與其中。這一過程通常從來自先天免疫系統的抗原遞呈細胞（APCs）開始。蛋白藥物經過靜脈或皮下等系統給藥途徑進入體內后，在到達靶部位之前，就會遇到來自血液、皮膚或淋巴管中的APCs（如樹突狀細胞, DC），代表性的DC細胞群包括皮膚中的DC、血液中的漿細胞樣DC、肝臟中的枯否細胞及大腦中的小膠質細胞。這群細胞可以整合生物分子本身及其周圍微環境中的信號，并轉化為內部下游信號，最終決定是免疫耐受還是產生免疫原性。DC細胞幾乎存在于人與外界環境接觸的所有區域。

DC通過內吞作用攝取蛋白藥物。DC細胞吸收蛋白藥物主要依賴兩條路徑：1）降解途徑，即通過酸性小體/溶酶體將蛋白分解成肽段，并加載到主要組織相容性復合體Ⅱ上，之后呈遞到細胞表面；2）非降解途徑，通過內吞、再循環、再釋放，延長生物藥半衰期。

降解途徑主要通過幾個表面受體家族和受體非依賴的巨胞飲作用實現。目前研究比較多的受體包括：1）模式識別受體，比如熱休克蛋白受體或Toll樣受體；2）C-type lectin家族，如DEC-205、DC-SIGN；3）Fcγ受體；4）MHC-Ⅱ蛋白家族，如HLA-DR、HLA-DQ；5）CD1蛋白家族；6）補體受體。這些受體可以使不成熟DC捕獲、內吞大量蛋白藥物，比如治療性抗體、多肽、脂質、多糖或糖蛋白。不成熟DC細胞還能以巨胞飲這種被動擴散的非受體依賴的形式攝取目標蛋白。

DC細胞的非降解途徑主要通過3個受體實現：1）甘露糖受體；2）FcγRⅡB；3）新生兒受體（FcRn）。甘露糖受體通過結合含甘露糖的蛋白，介導其內吞，并轉運至再循環內體中，阻止了被溶酶體降解。FcγRⅡB可以捕獲蛋白藥物-抗藥抗體免疫復合物（ICs），并將ICs再循環到細胞表面，主要意義在于保護了外周的ICs，被DC從外周順利運送至脾臟，并激活B細胞。相反，肝臟枯否細胞表面的FcγRⅡB結合ICs后，會直接將其轉運至溶酶體，并發生降解，從而降低了藥物的半衰期。所以，不同解剖位置的DC細胞表面的FcγRⅡB介導的作用有可能是完全相反的。FcRn這個受體大部分人相對比較熟悉，具備延長IgG分子半衰期的作用。DC細胞表面的不同受體及配體清單如下表所示。

DC細胞的攝取、處理和遞呈只是走完了ADA形成的第一步。作為T細胞表位的降解肽段，會與DC表面的MHC-II分子形成非共價分子復合物。這些肽-MHC-II復合物會被適應性免疫系統中CD4+輔助性T細胞表面的相應T細胞受體（TCRs）特異性識別，從而激活輔助性T細胞，進而激活適應性免疫系統中的特定B細胞。T細胞和B細胞之間的這種相互作用也依賴于TCR對特定肽-MHC-II復合物的識別。同時，這些B細胞還會通過膜結合抗體（即B細胞受體，BCRs）選擇性識別蛋白藥物上的B細胞表位。這一免疫過程最終導致B細胞分化為漿細胞，漿細胞分泌抗藥抗體。這其中，Na?ve B細胞激活又分為CD4+T細胞依賴型和非依賴型。不過，超過90% ADA的形成是依賴CD4+T細胞的。

CD4+T細胞非依賴型：BCR識別的表位（B cell epitope）既可以是線性的，也可以是3D空間結構。如果脾臟邊緣區的B細胞直接與攜帶抗原的DC細胞接觸，就可以不依賴T細胞，直接活化B細胞。這種抗原有一定特征，通常是帶有重復的蛋白表位或某些多糖（如革蘭氏陽性細菌細胞壁中的重復多糖），這些抗原可以直接通過交聯多個BCRs或同時激活BCRs和Toll樣受體來直接激活B細胞。交聯可以增強信號強度，對其它輔助細胞的依賴就會減弱。另外，這類ADA通常是IgM亞型，且與抗原的親和力偏低。最后，這類ADA反應不具備免疫記憶性。

CD4+T細胞依賴型：與IgM相反，IgG、IgE亞型的ADA通常是高親和力、具備免疫記憶，且依賴CD4+T細胞。與B細胞識別的表位不同，T細胞識別的表位通常是12-30個氨基酸的短的線性肽。主要是由DC或B細胞降解產生，并由MHC-Ⅱ遞呈到細胞表面。當CD4+T細胞識別這些肽段后，在共刺激分子協助下，開始增殖，分泌細胞因子。當活化的CD4+T細胞遇到含有相同肽段的B細胞后，就會促進這些B細胞活化、分化，形成可分泌IgG、IgE亞型ADA的漿細胞。

ADA產生過程如下圖所示。

蛋白質治療藥物首次引發的ADAs通常是低親和力的IgM型抗體。隨后，B細胞中的DNA重組會導致抗體亞型轉換為IgG、IgE或IgA。此外，抗體基因的快速突變（體細胞高頻突變）可能會產生更高親和力的抗體變體，這一過程稱為親和力成熟。在免疫反應成熟過程中，還可能發生表位擴展，導致ADAs針對蛋白藥物上其他表位。

抗體治療藥物與其相應抗原之間形成的免疫復合物可以促進抗原呈遞和ADA形成。例如，抗TNFα抗體英夫利西單抗與TNFα形成的免疫復合物會增加APCs呈遞英夫利西單抗衍生肽段的MHC-II類分子。抗TNF/TL1A雙特異性抗體AMG966在幾乎所有接受治療的健康志愿者中都引發了ADA，導致藥物暴露量減少。AMG966與TNF和TL1A形成了大的免疫復合物，增強了其去糖基化Fc與FcγR1A和FcγRIIIA的結合。免疫復合物與FcγR的結合有助于AMG966的ADA產生。

ADA危險因素和免疫耐受

以疫苗為例，疫苗抗原被DC攝取后，T和B細胞并不足以被激活，不能形成足夠的中和抗體。這就不得不提到佐劑的作用。佐劑主要是提供共刺激信號，上調DC和B細胞表面共刺激分子的表達，如CD40、CD86。或者上調活化T細胞表面CD40配體的表達。可以發揮類似佐劑作用的物質包括內毒素、熱休克蛋白、細菌肽、脂類、多糖、病毒RNA/DNA序列。對于生物藥來講，則可以是雜質、賦形劑，如表面活性劑或金屬離子。甚至注射針頭給藥刺激，也會提供共刺激信號。以上都可以作為提升ADA風險的危險信號。

有危險信號，自然也有免疫耐受情況。目前有以下幾種方式可以誘導外周免疫耐受：1）激活天然CD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞，即nTreg；2）蛋白本身包含Treg表位，即Tregitopes；3）誘導抑制性DC產生，這類DC細胞可分泌IL-10，并促進誘導型Treg(iTreg)產生；4）誘導漿細胞樣DC產生，這類DC細胞可激活Treg，抑制效應T細胞作用；5）口腔粘膜給藥，有證據表明當其它給藥途徑會產生高滴度ADA的干擾素，經粘膜給藥后，免疫原性消失。所以，臨床有開發干擾素α2b噴霧劑。原理也是與激活抑制性DC和iTreg有關；6）高劑量給藥誘導免疫耐受：Infliximab或Abciximab重復高劑量給藥后，免疫原性降低。推測原因是這類蛋白含有Tregitopes，激活nTreg需要DC細胞表面的高拷貝數的HLA-Tregitope，所以劑量越高，激活Treg的可能性越高。

影響ADA產生的風險因素

蛋白藥物的免疫原性受到多種風險因素的影響，這些風險因素分為三大類：與產品相關、與患者相關以及與疾病相關，每一類又能具體細分為很多亞類，如下表所示。

1、產品方面

首先比較重要的是藥物分子本身的特點，或者“先天因素”，首當其沖的就是氨基酸序列。嵌合抗體或融合蛋白中的非人源序列會增加免疫原性風險。但是，與分子量大的蛋白藥物相比，含非人源序列的短肽更容易成為T細胞表位，免疫原性風險也會高很多。因為，這類短肽不需要內吞或蛋白降解，可以直接與DC細胞表面的MHC-Ⅱ分子結合。

生物藥的聚體形式更容易成為B細胞表位，這類聚體可通過交聯BCR激活B細胞，并且不需要共刺激信號，也不依賴T細胞的輔助。

除序列外，宿主細胞蛋白、化學合成多肽的副產物均會增加neo-epitopes風險，并可能發揮佐劑樣作用，增強共刺激，增加免疫原性風險。

產品制劑方面，純度、處方、劑量三個方面對免疫原性的影響需要考慮。尤其制劑的賦形劑成分，如表面活性劑，有增強共刺激信號的風險。

劑量和給藥方案對ADA的影響也很關鍵，比較低的劑量下，產生的T細胞表位數量少，可能達不到充分激活T細胞的閾值。非常高的劑量下，則有可能引起免疫耐受，抑制免疫反應。除了給藥劑量，給藥頻率對ADA也有影響。每天給藥或更高頻的給藥方案，會導致Treg的激活，從而降低免疫原性風險。

藥物靶點和作用機制對ADA也有影響，有些靶點位于免疫細胞，具備免疫調節活性，這類分子的免疫原性需要重點關注，比如CD40或CD25位于DC或其它APC細胞表面，產生ADA的風險較其它靶點要高。又如增強機體免疫的T細胞連接器，潛在ADA風險也會高一些。

2、患者和疾病方面

關于這點，需要重點考量的是患者的遺傳背景。首當其沖的是人類白細胞抗原Ⅱ（HLA-Ⅱ）的基因型，因為HLA-Ⅱ決定著蛋白藥物是否攜帶合適的T細胞表位。再就是編碼全部TCR和BCR的基因，決定著能否識別任一T細胞或B細胞表位。此外，細胞因子基因多態性決定了T細胞和B細胞激活的閾值。其它風險因素包括患者給藥之前或平行服用的其它藥物。比如給予甲氨蝶呤或可的松這些免疫抑制藥物，自然會降低藥物的免疫原性風險。

不同疾病背景下，患者免疫狀態不同，比如腫瘤和自身免疫性疾病。以嵌合CD20抗體rituximab為例，在淋巴瘤和白血病患者的ADA發生率很低（<2%），但當其用于治療類風濕關節炎時，ADA發生率提高了10倍以上。

當然，ADA的發生風險往往不是來自單一因素，而是多因素交織在一起，共同發揮作用，從而引起免疫原性相關的不良反應或影響藥物的藥代動力學行為。

免疫原性風險測定

在臨床前開發階段，用于免疫原性風險評估的方法通常聚焦在T細胞依賴性ADA生成中的各個步驟。通過一些工具預測線性肽與MHC-II結合的緊密程度，或者預測肽段（T細胞表位）被MHC-II遞呈的概率。通過計算機模擬方法預測的T細胞表位數量與觀察到的臨床ADA發生率之間至少是存在一定的弱相關性的。

以上如果算作干實驗，還有些濕實驗方法可用于免疫原性風險評估，比如樹突狀細胞負載實驗（dendritic cell loading assays），模擬APCs對蛋白藥物的攝取。又如，APC中MHC-II遞呈的肽段，可以通過MHC相關肽段蛋白質組學（MAPPs）識別。此外，也可以直接測量肽段與MHC-II的結合。輔助T細胞的激活可通過檢測生物標志物（如IL-2分泌）或細胞表面CD134和CD137表達來進行檢測。T細胞增殖可通過使用熒光染料（如羧基熒光素琥珀酰亞胺酯）或通過[3H]-胸苷或溴脫氧尿苷摻入來測量。

免疫原性的評估除了體外工具可用，自然也離不開體內評估。只不過，體內評估蛋白藥物的免疫原性風險存在諸多挑戰，因為臨床前動物模型和人體免疫原性結果的相關性有限。小鼠免疫系統與人體系統在ADA生成機制方面存在諸多差異，包括MHC庫和抗原呈遞。即使是可以產生人IgG1抗體的轉基因小鼠，這種差異也依然存在。別說小鼠，即使是非人靈長類比如猴，觀察到的ADA也不具備人體預測能力。比如抗體類藥物，非人靈長類動物中ADA的發生率與人體相當的情況僅占約59%。

那么ADA風險怎么評估更合適呢？建議是多種不同方法交叉評估，包括基于計算機的T細胞表位預測、APC細胞對蛋白的攝取、通過MAPPs對MHC-II免疫肽組進行特征分析等，并以不同ADA發生率的蛋白藥物作為對照，emicizumab為5.1%；etanercept為3.6%-8.7%；abciximab為5.8%-44%；romosozumab為18.1%；blosozumab為35%；hA33為62.2%；bococizumab為48%。

降低免疫原性風險

降低免疫原性風險的最簡單方法是選擇一個符合目標候選物特征且在不同免疫原性檢測中綜合評分較低的分子。如果沒有發現這樣的低風險候選分子，可以選擇對更多候選物進行免疫原性風險篩查。或者，也可以嘗試對現有候選物進行去免疫原性處理，如去除可能的T細胞或B細胞表位。當然，后者處理起來挑戰頗大，因為去除所有潛在的T細胞表位比較耗時且難以實現，但保留下來的某一個T細胞表位也可能對ADA產生重大影響。而且，去免疫原性的同時，還要兼顧藥物的生物學活性和可開發性，不能顧此失彼。Emicizumab是一款抗IXa/X雙特異性抗體，在分子設計階段通過計算機模擬預測并隨后移除T細胞表位，即去免疫原性處理，在Ⅲ期臨床試驗中觀察到的ADA發生率比較低（5.1%）。

對于抗體治療藥物，已采用多種方法來降低其免疫原性風險。在超過170種獲批的治療性抗體中，只有大約8種是鼠源抗體。因免疫原性問題，鼠源抗體臨床開發的成功率較低。意識到這一問題之后，后續已經開發出多種技術，通過用人類序列替換鼠源序列來降低鼠源抗體的免疫原性。包括20世紀80年代初提出的嵌合抗體——鼠源恒定區采用人源替代，僅保留結合抗原的鼠源可變區。幾年后，Greg Winter開創了一種更復雜的蛋白質工程方法，即抗體人源化。在人源化過程中，僅保留鼠源抗體中關鍵的互補決定區以及可變區中影響抗原結合的關鍵框架區殘基，而其余部分為人源序列替代。隨后，從20世紀90年代開始，開發出了高效的全人抗體生成途徑，包括人體抗體片段的噬菌體展示文庫和全人抗體轉基因小鼠。后續酵母展示文庫等其它技術進一步加強了人源抗體的獲得路徑。當然，高度人源化只是從概率上降低了ADA發生率，并不意味著與ADA低發生率之間的絕對相關。畢竟序列只是影響ADA發生的其中一個因素而已。

ADA對藥物ADME的影響

1、ADA對生物樣品分析結果的影響

如果形成ADA，那么蛋白藥物在體內就有兩種存在形式，一是游離分子，二是與ADA結合的免疫復合物形式（ICs）。所以，我們需要弄清楚，建立的生物分析方法檢測的是哪些成分，是游離分子，是ICs，還是所有形式藥物總和。同理，如果建立的生物分析方法檢測不到血藥濃度了，也有幾種可能，一是ADA的結合影響了檢測，比如開發的檢測配對抗體結合表位與ADA有交叉結合；二是ICs的形成加速了體內清除的過程。前者情形說明藥物還在以ICs形式在體內循環，這種ICs可能依然具備藥理活性，應該結合PK/PD結果進行關聯分析，尤其是PK與PD不一致的時候。

2、免疫復合物的形成

ADA可以是中和抗體，也可以是非中和性質的。中和抗體比較容易理解，就是抗藥抗體的結合位點，對于藥物發揮生物學作用比較關鍵，比如結合在抗體藥物的CDR區域。非中和抗體則相反，結合位點不太關鍵。兩種類型抗體都會影響藥物的清除，ADA產生的越多，這種影響越明顯。

ICs的大小取決于蛋白藥物表位的多少。如果藥物只有一個B細胞表位，僅形成小的ICs，不能形成大的或者交聯形式的復合物。相反，如果攜帶多個B細胞表位，則會形成比較大的ICs。特別提一下抗體藥物，因其結構原因，抗體藥物如果有B細胞表位，一般至少是兩個。除了表位數量，藥物與抗藥抗體的比例也是影響ICs大小的關鍵。如果是1:1的比例，則容易形成下圖C和D中的IC形式。Johansson及其團隊在體外將抗體與抗藥抗體1:1混合，發現主要形成的下圖C中的環狀四聚體，其次是D圖中的環狀六聚體，甚至還有八聚體和16-20聚體的存在。線性+開環鏈式聚體（圖B）與環狀聚體占比分別為30.3%和67.8%。當藥物與ADA的比例不是1:1，無論藥物過量還是ADA過量，更容易形成小片段的ICs。所以蛋白表位的多少及蛋白與抗藥抗體的比例對于ICs的形成、大小比較重要。

3、免疫復合物的清除

ICs的清除很大程度上取決于分子的大小。包含1個或2個IgG的小ICs既不能激活補體，也不能交聯Fcγ受體，可以持續在外周血循環，不會被免疫清除。大點的ICs可以激活補體，并被肝臟和脾臟的吞噬細胞攝取。沒有補體的情況下，也會被外周血中的DC、巨噬細胞、單核細胞非特異性胞飲內吞或被更有效率的受體介導的內吞清除。這里請注意，DC細胞不只介導蛋白藥物的攝取、遞呈，也參與對后續形成的蛋白藥物/ADA的免疫復合物的清除。

聊幾句種屬差異，在人和靈長類動物中，IgG1和IgG3亞型ICs主要激活經典的補體途徑，即先結合C1q，再結合C3b，之后結合紅細胞的補體受體（CR1），并被紅細胞轉運至肝臟或脾臟，最后通過FcγRⅠ、FcγRⅡA、FcγRⅢB、CR1、CR2、CR4或甘露糖受體被肝臟枯否細胞或脾臟巨噬細胞吞噬、清除。其中，FcγRⅠ與IgG單體的親和力很高（KD~10-9M），FcγRⅡA、FcγRⅢB與IgG單體的親和力就低很多，分別是>10-7M、>10-6M。因此，FcγRⅡA、FcγRⅢB主要介導多聚形式ICs的攝取。然而，嚙齒類動物并不是依賴紅細胞轉運ICs的，而是血小板，這點是有種屬差別的。

ICs被吞噬細胞或造血細胞攝取后，主要暫存于早期內體中。在pH<6.5的酸性pH條件下，ICs與FcγR的親和力消失，發生解離，轉而結合FcRn，并由FcRn完成后續的處理。對于單體IC（如上圖A中所示），FcRn的處理類似于未形成復合物的免疫球蛋白藥物，發揮的是保護作用。但是，對于多聚ICs，則被FcRn轉運至溶酶體，并被降解，發揮清除作用。因此，FcRn給予不同大小ICs的待遇是不一樣的。

4、ADA是延長蛋白藥物半衰期還是加速藥物清除？

對于分子量小于70KDa的蛋白藥物，主要經腎臟消除，ADA的結合使分子量增加，不再經過腎臟消除，可以增加藥物的持續時間。比如IL-2Rα，90%經腎消除，半衰期約4.8h，結合ADA后，半衰期延長到38h。又如IL-10，分子量35KDa左右，小鼠中的半衰期約0.04天，結合ADA后，半衰期延長到1.16天。

對于分子量比較大的蛋白藥物，比如抗體，ADA通常會加快這類藥物的清除。如果形成的是小的ICs，FcRn的保護作用雖然打了折扣，但還能保留幾成功力，所以只是在一定程度上加快了清除，但幅度有限。但是，大的ICs，不僅FcRn的保護作用完全失去，轉而會導致藥物的快速清除。即使產生的ADA是非中和抗體，這種清除速度也會使藥物藥效大打折扣。當然，中和抗體性質的ADA對藥物的影響就更嚴重了。但某些藥物ADA的形成是一過性的，當ADA消退后，藥物的消除又回到正常狀態。當然，還有些特例情況，比如中和性質的ADA結合藥物后，會阻斷藥物與靶點的結合，降低靶點介導的藥物處置（TMDD），反而降低了藥物的清除。

案例：動物試驗中的加速清除

1.74mg/kg的Infliximab靜脈輸注給予食蟹猴，30分鐘后，再給予0.5mg/kg的anti-infliximab抗體。5分鐘后即形成ICs。大的ICs（>670KDa）被快速清除，24h的時候就已經檢測不到。小的ICs可以持續存在，消除半衰期37.5h，比infliximab的105h短，但比大的ICs半衰期長。

5、ADA對分布的影響

ADA不僅會對藥物的消除有影響，對分布的影響也不容忽視。對于小分子量的蛋白藥物，如多肽，ICs的形成會降低藥物的組織滲透能力，同時降低了藥物的腎清除，增加了在肝臟的富集和清除。比如，游離IL-10主要通過腎臟清除，腎臟的濃度明顯超過肝臟。當結合抗IL-10抗體后，新的復合物主要分布到肝臟，腎臟只有很少的攝取。這點對于大分子量的生物藥也適用，當結合抗藥抗體形成ICs后，肝臟和脾臟的分布及攝取增加，藥物清除速度加快。

ICs可能會在腎小球、血管、滑膜、肺、肝、皮膚、眼睛、脈絡叢等組織沉積。通常，小ICs較大ICs沉積的風險低。可能由于ICs清除路徑飽和，導致大的ICs不能被快速清除。將小ICs和大ICs混合后注入小鼠，只要血循環中存在大的ICs（>mAb2ADA2），ICs在腎小球的沉積就會被觀測到。還有一種解釋ICs組織沉積的理論，帶正電荷的ICs與細胞表面的負電荷的相互作用會促進凝集。ICs沉積的危害還是挺大的，比如會引發腎小球腎炎的風險。

6、ADA對藥物吸收的影響

關于ADA對生物藥吸收影響的相關研究非常少。在給藥間隙如皮下，或者引流淋巴結是能發現ADA存在的。藥物經過皮下給藥后，或經過淋巴吸收后，會與ADA形成ICs，分子量出現比較大的變化，從而可能影響藥物吸收速率或程度。

如何處理ADA對ADME的影響

1、處理ADA存在情況下的PK檢測

無論開發什么樣的PK檢測方法，檢測游離藥物的也好，檢測結合ADA的藥物也好，ADA對方法學準確度的影響其實都會存在。不過，畢竟蛋白藥物大部分是人源序列，相對于動物，人體的免疫原性風險是低的。一個簡單粗暴的處理方法是，在計算PK行為時將ADA陽性的個體排除在外。

2、通過高劑量給藥誘導免疫耐受

IFN-β臨床通過SC或IM給藥，治療多發性硬化癥。治療過程中會出現中和抗體，并影響藥物的藥效。研究發現，臨床輸注高劑量IFN-β會降低中和抗體滴度。原因有二：1）短期輸注大量IFN-β會使中和抗體飽和，過量的IFN-β可以繼續發揮藥效；2）長期看，高劑量IFN-β會引起免疫耐受。這一情況在IL-6受體抗體中也有發現。

3、通過免疫調節控制ADA負面影響

25%的A型血友病患者給予凝血因子VⅢ（FVⅢ）會產生中和抗體。如前文所述，通過提高劑量，給予大劑量FVⅢ可以抵消中和抗體的影響。不過，除了這個方法以外，最近的研究又出現了新的方案。通過將FVⅢ與CD20抗體rituximab聯用，也達到了降低中和抗體滴度，解除中和抗體負面調控的效果。主要原因是rituximab耗竭了B淋巴細胞，使抗體的產生受到影響。

又如治療龐貝病的酶替代療法-α葡萄糖苷酶（rhGAA）。兒童給予rhGAA后，會出現持續高滴度的中和抗體，極大的影響了治療效果。通過同時給予rituximab、甲氨蝶呤等免疫調節藥，可引起免疫耐受，降低ADA的影響。

TNF-α抗體infliximab是人鼠嵌合抗體，鼠源成分的比例較傳統人源化、全人源抗體高。臨床同樣面臨ADA影響生物利用度、增加輸注反應風險的問題。通過給予免疫抑制藥物如硫唑嘌呤、巰基嘌呤或甲氨蝶呤可以抑制ADA的形成，降低輸注反應發生率，優化治療效果。

4、其它新型克服免疫耐受的方法

一種是在藥物發現階段，就對序列中的T或B細胞表位進行突變改造，從源頭降低風險。另外一種是通過改變給藥途徑降低ADA風險，比如鼻吸入給藥、消化道粘膜上皮給藥等更容易激活Treg，增強免疫耐受。

ADA的檢測

免疫原性評估應納入每一項臨床研究的方案設計中。由于ADA的多克隆性和異質性，無法為ADA樣本賦予一個絕對定量的濃度。相反，ADA反應的強度通常以半定量的滴度單位表示。滴度值反映了ADA的濃度和親和力。ADA通常采用分層檢測策略來評估臨床研究樣本。目前常用的免疫原性檢測范式是篩選、確認和表征（滴度檢測）三級檢測。篩選的目的是去除陰性樣本，畢竟不太可能對所有樣本開展滴度檢測。但篩選也保留了一定的假陽性率。所以，確認這一步目的就是去除假陽性樣本。最后一步是對確認陽性的樣本進行滴度和中和活性檢測。目前有多種平臺可用于ADA分析，包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和電化學發光免疫分析等。

典型的免疫原性三級檢測步驟如下圖所示，先對樣本進行第一級的篩選，之后對篩選陽性的樣本加樣確認，最后對確認陽性的樣本進行滴度檢測和中和活性確認。實際工作中，并不是對所有階段的臨床樣本均進行完整的三級檢測。比如，中和活性檢測通常在關鍵三期臨床才開展。