CAR-T細胞治療藥物的生產制備和表征

在過去的幾十年中，基于嵌合抗原受體（CAR）T細胞的細胞療法徹底改變了癌癥的治療方式，尤其是血液系統疾病。CAR-T細胞是經過基因工程改造的T淋巴細胞，能夠識別特定抗原，其結構由四個部分組成。第一部分是外部結構域，該結構域負責與靶抗原結合，決定了CAR-T的親和力和特異性。它通常由單鏈可變片段（scFv）組成。第二部分是鉸鏈區，通常由IgG1或IgG4的鉸鏈-CH2-CH3Fc結構域，或CD4、CD8、CD3ζ或CD28的部分組成。鉸鏈區對于CAR-T細胞激活，并攻擊腫瘤靶細胞至關重要。它還連接scFv與CAR結構的第三部分——跨膜區。跨膜區調節CAR信號傳導，并控制CAR在T細胞表面的表達。CAR結構的最后一個部分是細胞內信號傳導區，其組成在不同代CAR-T細胞中有所不同，但所有CAR-T細胞中均包含CD3ζ信號傳導區。

CAR技術的優勢在于其對靶抗原的特異性和對腫瘤細胞的強大細胞毒性。隨著CAR-T細胞的發展，細胞內信號傳導區不斷優化，以降低毒性并提高效率。第一代CAR-T細胞結構最簡單，僅包含外部結構域、跨膜結構域以及CD3ζ作為細胞內信號傳導區。第二代CAR-T細胞在細胞內信號傳導區增加了共刺激結構域（如CD28或4-1BB），以增強T細胞多次暴露于抗原后的增殖能力。第三代CAR-T細胞同時包含CD28和4-1BB兩種共刺激結構域。第四代CAR-T細胞也稱為“T細胞重定向用于通用細胞因子殺傷（TRUCK）”，其特點是增加了細胞因子（如IL-12）的表達模塊。這些細胞因子由CAR-T細胞釋放，用于調節T細胞反應、增強NK細胞的激活，并將巨噬細胞極化為對抗腫瘤細胞的M1表型。除了IL-12，IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-23和IL-27等細胞因子也在研究中。第五代CAR-T細胞結構中包含截短的細胞質IL-2受體β鏈結構域，該結構域能夠與轉錄因子信號轉導和激活轉錄因子3（STAT3）結合。當T細胞與抗原結合時，會同時激活TCR（通過CD3ζ結構域）、共刺激結構域（CD28結構域）以及細胞因子JAK-STAT3/5信號通路。IL-2受體β鏈結構域和JAK-STAT通路可促進細胞增殖，防止細胞終末分化。

CAR-T細胞療法在治療B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者中取得了前所未有的高完全緩解（CR）率。截至目前，FDA已經批準了7款基于CAR-T細胞的療法，相關信息總結如下表。

CAR-T細胞療法的有效性無可爭議，但這種治療方法也有其局限性。只有少數接受治療的患者實現了CR。同時，許多患者遭受了嚴重的毒性，包括細胞因子釋放綜合征（CRS）、免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS），甚至在某些情況下導致死亡。此外，相當數量的患者（高達66%）在治療后出現復發。

CAR-T細胞療法的成功與否在很大程度上受到生產過程的影響。每一個步驟都面臨挑戰，并且可以進一步改進。比如自體或異體T細胞的收集，以及它們在輸注前的耗竭狀態，對CAR-T細胞療法的療效有重大影響。另外，體外過度刺激T細胞會導致其早期耗竭，而轉染方法可能導致T淋巴細胞的惡性轉化。本文總結了體外CAR-T細胞的純化、擴增和表征方法。

起始物料選擇

自體和異體移植

CAR-T細胞制造的初始步驟是選擇和收集起始材料。在自體CAR-T細胞療法中，T細胞是從患者體內提取的，并在經過實驗室改造后重新輸注回同一位患者體內。而在異體移植（通常稱為“現貨型/健康供體”）中，T淋巴細胞來源于健康供體，并被輸注給癌癥患者。這兩種程序各有優缺點。

自體移植的優點是沒有移植物抗宿主病（GvHD）的風險，并且與異體移植相比，細胞在體內的持久性更長。然而，自體T細胞療法也面臨諸多挑戰，包括復雜的生產過程、高成本、T細胞的變異性、由于先前腫瘤治療導致的T細胞耗竭和功能障礙等。CAR-T細胞的療效在很大程度上取決于純化T淋巴細胞的特性，而這些特性可能受到患者年齡、癌癥類型、既往治療以及T細胞被癌細胞污染風險等因素的影響。為解決自體CAR-T細胞移植的挑戰，異體CAR-T細胞療法被作為一種潛在解決方案。異體療法提供了一種均質化、標準化且易于獲取的選項，成本較低，且有可能實現多次給藥。更重要的是，異體CAR-T細胞療法可能特別適合用于侵襲性腫瘤，因為它消除了產品被惡性T細胞污染的風險。然而，異體移植的局限性包括GvHD的風險以及宿主介導的免疫排斥反應，即受者的免疫細胞攻擊輸注的CAR-T細胞，從而削弱其療效。

為緩解這些問題，已開發出多種策略。例如，可通過使用抗CD52抗體（如阿侖單抗）來消除宿主的CD52+異體反應性T細胞，這些細胞負責耗竭注入的CAR-T細胞。為此，必須在輸注前通過基因編輯破壞CAR-T細胞內源性CD52的表達。基因編輯還可以靶向TCR和人類白細胞抗原（HLA），以進一步降低異體反應性。另一種策略是采集具有不同亞群的T淋巴細胞，例如攜帶γδTCR的T細胞，因為它們的細胞毒性比傳統用于CAR-T細胞產品的αβTCR更強。最后，重新輸注分化程度較低的細胞群體，如多能干細胞、前體T細胞或臍帶血細胞，可能會降低GvHD的風險。

T細胞富集方法

CAR-T細胞療法的起始材料是患者或供體的外周血單個核細胞（PBMCs）。PBMCs由70%-90%的淋巴細胞組成（其中包括70%-85%的CD3+T細胞、5%-10%的B細胞和5%-20%的NK細胞），單核細胞占10%-20%，樹突狀細胞（DCs）占1%-2%。PBMCs通過白細胞分離術或密度梯度離心從全血中分離出來，然后清洗以去除抗凝劑、紅細胞和血小板等雜質。去除血小板至關重要，因為血小板可以與免疫細胞聚集，并表達可能被熒光抗體標記的Fc受體，從而在流式細胞術中導致假陽性結果。

CAR-T細胞生產的第二步是通過選擇性富集T細胞群體。當然，這一步是可選項。通常利用帶有抗體的磁珠進行陰選和陽選。比如，使用抗CD4/CD8或抗CD3抗體偶聯珠子。FDA批準的其中6種CAR-T中，3種采用的陽選。具體而言，Brexu-cel和Liso-cel是通過抗CD4/CD8抗體偶聯珠子進行陽選得到的，而Tisa-cel則是通過抗CD3/CD28抗體偶聯珠子進行陽選得到的。陽選需要注意的是，當細胞表面的受體被抗體結合時，細胞可能會接收到信號，從而改變其行為。比如，CD8和CD4的結合可以通過增加炎癥細胞因子的釋放和增強毒性，影響T細胞生物學，與CD3/CD28富集相比更為顯著。此外，CD3/CD28選擇還可以富集γδT細胞，而這些細胞由于表面缺乏CD4/CD8標記，會被CD4/CD8選擇排除。γδT細胞的重要性在于其與良好預后密切相關，并具有天然的抗腫瘤功能。

陰性選擇是富集T淋巴細胞的有效替代方法，與通過CD4/CD8陽性選擇獲得的CAR-T細胞相比，陰性選擇得到的CAR-T細胞在擴增、轉導效率和表型方面相似。該過程使用抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD19和抗CD56抗體偶聯珠子的混合物，從PBMCs中去除單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、NK細胞和B細胞，而T淋巴細胞則未受影響。陰性選擇已在臨床（如Cilta-cel）和臨床前研究中被使用。

由于T細胞是PBMCs的主要成分，許多團隊選擇直接刺激它們，而無需專門富集T細胞群體。這種方法的可行性也得到了FDA批準的CAR-T細胞產品（如Axi-cel和Ide-cel）的支持。下圖展示了FDA批準的其中6款CAR-T產品的體外富集方法。

體外T細胞激活和分化

T細胞激活

CAR-T細胞的生產通常包括三個步驟：激活、轉染和體外擴增，至少需要6天。在自然狀態下，CD8?和CD4?T細胞在與結合到MHCⅠ類或MHCⅡ類分子上的靶抗原相互作用后，會激活、增殖并分化為各種短壽命的效應亞群。在體外，可以通過使用游離的或包被在磁珠上的抗CD3/CD28抗體來實現T細胞的激活，其中后者是體外T細胞激活最常用的方法，占CAR-T細胞產品的66%。在6種FDA批準的CAR-T細胞產品中，有3種使用抗CD3/CD28抗體進行T細胞激活，分別是Brexu-cel、Axi-cel和Ide-cel。常見的磁珠與細胞（B:C）比例為3:1。

當T淋巴細胞通過與其對應抗原結合而被激活時，它們會上調并表達如CD25和CD69等表面標志物。CD25被認為是晚期激活的通用標志物，它是IL-2受體的一部分，在激活的淋巴細胞和調節性T細胞上高表達，其表達量與激活程度相關。而CD69在TCR/CD3結合后迅速誘導，被認為是早期激活標志物，在激活后30-60分鐘可檢測到，4-6小時后水平下降。

T細胞分化

細胞因子對CAR-T細胞的質量和功能至關重要。IL-2、IL-7和IL-15影響T細胞的組成、質量和表型，顯著影響CAR-T細胞療法的體內療效。它們還可以在體外誘導T細胞增殖。IL-2已廣泛用于CAR-T細胞生產的制造方案中，包括FDA批準的療法，如Brexu-cel和Axi-cel（300U/mL）。其中，300U/mL和100U/mL是最常用的T細胞激活濃度，而較低的濃度如20U/mL、40U/mL、50U/mL和200U/mL也被使用。

盡管IL-2被廣泛使用，但它可能導致一種相對成熟的表型（CD62LlowCCR7+CD27+CD28+），這種表型更有利于調節性T細胞的擴增，而不是記憶T細胞。因此，選擇富含記憶細胞的群體，特別是記憶T干細胞（TSCM）至關重要。這些細胞在體內表現出更好的持久性、定植能力和療效，與分化程度更高的表型（如效應T淋巴細胞）相比具有優勢。TSCM的增強療效主要歸因于它們能夠像干細胞一樣進行多次細胞分裂，迅速生成高度增殖、自我更新、多能的后代細胞，這些細胞能夠快速對抗原產生響應。T細胞的增殖和存活與抗腫瘤療效和體內持久性相關，故富集TSCM和中央記憶T細胞（TCM）是CAR-T細胞療法的研究重點。可以通過在移植前限制T細胞的體外增殖以及刺激IL-7和IL-15受體來實現，這些受體可以減輕T細胞的終末分化，并增加記憶干細胞的比例。與用IL-2刺激的T細胞相比，用IL-7和IL-15刺激的T細胞表現出更低的耗竭標志物表達、更高的促炎細胞因子分泌以及更強的抗腫瘤效果。然而，這個方向目前還有一些爭議，促進TSCM富集的最佳細胞因子組合尚未明確。目前對于使用IL-7和IL-15也未沒有共識；一些團隊甚至報告說IL-2刺激可以誘導TSCM表型。此外，通過IL-7和IL-15刺激獲得的TSCM比例差異很大，范圍從10%-30%到60%-70%，這可能會影響CAR-T細胞的療效。

活化的T細胞轉染

病毒法轉染

病毒已經成為CAR-T細胞基因改造的標準臨床方法。這種方法可以確保遺傳物質整合到宿主細胞基因組中，實現高轉染率和轉基因的長期穩定表達。病毒載體主要有兩大類：γ-逆轉錄病毒和慢病毒。γ-逆轉錄病毒只能轉導分裂細胞，因此需要激活細胞，而慢病毒可以轉導分裂和靜止細胞。

在FDA批準的其中6種CAR-T細胞產品中，33%（Axi-cel和Brexu-cel）使用了γ-逆轉錄病毒，而67%是基于慢病毒介導的轉導。

目前，沒有確鑿證據表明哪種病毒載體更好。病毒載體的一個主要問題是潛在的癌基因插入風險。然而，在臨床中尚未觀察到相關病例。此外，通過瞬時轉染生產慢病毒需要大量DNA，這會增加生產成本。慢病毒傾向于整合到轉錄活躍基因的內含子中，從而降低了癌基因插入的風險。相比之下，γ-逆轉錄病毒更傾向于整合到轉錄起始位點、增強子和啟動子附近。

非病毒法轉染

穩定基因轉移可以通過多種非病毒方法實現，包括轉座子、CRISPR/Cas9、mcDNA載體和納米顆粒（NPs）。

轉座子是能夠通過“剪切-粘貼”機制在基因組內改變位置的DNA序列。這一過程依賴于轉座子和轉座酶。轉座子攜帶目標基因，其兩側有反向末端重復序列，這些序列可被轉座酶結合。轉座子的優點包括生產成本低、無需臨床級載體、能夠高效且永久地插入基因組，且比病毒方法更安全。此外，轉座子轉染可以在激活的和靜止的原代T細胞中進行。在最新一代的CAR-T細胞中，同時轉移多個基因至關重要，而轉座子特別適合這一目的，因為它們可以攜帶比病毒更大的遺傳物質。然而，轉座子也有一些缺點，與病毒方法相比，生成CAR-T細胞所需時間更長，轉染效率較低。兩種最常用的轉座子/轉座酶系統——SleepingBeauty(SB)和piggy-Bac——分別可實現25%-80%和20%-40%的T細胞轉染效率。

CRISPR/Cas9技術是轉座子的有前景的替代方法，可實現約20%-60%的CAR+細胞比例。該技術源自細菌和古菌的免疫系統，利用與目標DNA序列互補的短RNA片段（導向RNA或gRNA），引導Cas9酶到達這些特定序列。Cas9隨后切割原始DNA，利用細胞的DNA修復機制引入新基因。CRISPR/Cas9是一種簡單、靈活且精確的方法，可在基因組的預定位置整合多個轉基因。該技術當前的挑戰包括優化和標準化基因編輯過程以提高穩定性和效率，以及減少或消除最近發現的基因組編輯的后果——染色體丟失。

另一種有效的非病毒機制是使用CARmcDNA載體結合電穿孔將CAR結構轉染到T細胞中。這些mcDNA載體源自含有CAR序列的超螺旋親本DNA載體。在轉化到ZYCY10P3S2T大腸桿菌后，親本載體發生重組，產生兩個產物：CARmcDNA載體和一個包含細菌來源和抗生素基因的質粒骨架。后者在培養基中加入L-阿拉伯糖后被I-SceI內切酶降解。mcDNA載體的優點包括由于缺乏殘留細菌成分而無免疫反應，且在細胞內持久存在。通過mcDNA轉染可實現超過50%的轉染效率，超過慢病毒方法。然而，從質粒中去除細菌成分可能復雜，且常導致產量低和細菌基因組DNA污染。

2017年，史密斯等人發表了一篇有趣的文章，展示了載有CAR編碼質粒的聚合物納米顆粒在體內誘導T淋巴細胞表達CAR的效率，其特異性由抗CD3抗體介導的納米結構實現。此后，還出現許多其他平臺，包括脂質納米顆粒、納米管和各種聚合物納米結構。然而，納米顆粒并非沒有局限性。擴大生產工藝可能復雜，且必須認真考慮納米顆粒的潛在毒性。

CAR-T細胞的細胞毒性

評估CAR-T細胞體外殺傷能力的第一步是進行細胞毒性實驗。迄今為止，文獻中已經描述了四種主要的實驗方法：鉻（51Cr）釋放實驗、流式細胞術（通過活/死細胞染色）、熒光素酶活性檢測以及細胞脫落（阻抗法）。每種方法都有其自身的優缺點。

效應細胞與靶細胞（E:T）的比例是影響CAR-T細胞體外療效的最關鍵參數。文獻中已經測試了多種E:T比例，例如1:1、3:1、5:1、10:1和20:1。這些研究評估了體外癌細胞的殺傷百分比以及細胞因子的釋放。由于抗原的差異、實體瘤與血液瘤的性質不同以及CAR生成的具體情況，目前尚未就每種CAR-T細胞和癌細胞組合的最佳條件達成共識。通常，設置的E:T比例可導致血液和實體腫瘤細胞的殺傷率在40%到95%之間。

除了細胞毒性外，細胞因子定量是確定CAR-T細胞體外功能的最重要指標之一。可以采用ELISA檢測。最常被定量的細胞因子包括INF-γ、IL-2和TNF-α，以及GM-CSF和顆粒酶B。酶聯免疫斑點試驗（ELISpot）、流式細胞術和細胞內染色（ICS）等方法也可以考慮。

引自：CAR-T Cell Manufacturing for Hematological and Solid Tumors: From the Preclinical to Clinical Point of View