如何從藥理學角度提升藥物研發成功率

小分子藥物發現篩選技術進展很快，包括細胞檢測、計算篩選以及借助結構生物學的生物物理學方法。技術的進步提高了篩選命中率，并使得針對難成藥靶點的候選藥物篩選成為可能。然而，候選藥物在臨床試驗中的失敗率仍非常之高，療效不足是主要原因之一。候選藥物因療效問題導致高失敗率可能有四個原因：1）對治療疾病所需的藥理作用理解不足；2）為實現預期效果選擇了不合適的靶點；3）所選候選藥物無法有效調節靶點；4）未能充分表征候選藥物的全部作用，且未在合適的目標群體中進行評估。

前兩個原因源于對疾病病理生理學缺乏全面了解，這仍將是新藥發現的挑戰，尤其是對于更復雜的疾病。這類疾病中，單一靶點無法被確定為疾病的關鍵成因，且患者間存在顯著異質性。后兩個原因則是與候選藥物的表征有關，也是本文將討論的主題。這其中，最受關注的靶點家族是G蛋白偶聯受體（GPCRs）。因為近期技術進步（如利用冷凍電子顯微鏡確定GPCR復合物結構）以及對該家族信號傳導細微差別的理解，揭示了調節GPCR以實現治療獲益的新方法。此外，變構調節和偏向信號傳導的融入，徹底重振了GPCR研究。當然，部分觀點可能適用于其他靶點家族，如激酶、核受體和離子通道。

藥物發現研究曾致力于尋找模擬內源性分子（如肽激素或神經遞質）激活GPCRs的激動劑，或阻斷這些內源性分子與其在GPCR上的結合位點（即正構位點）相互作用的拮抗劑。如今已知，GPCRs通過多種構象狀態介導復雜信號以影響生理過程，這些構象狀態可激活或阻斷涉及多種細胞內轉導分子（包括G蛋白、GPCR激酶和β-抑制蛋白）的特定信號通路。不能假設合成配體會產生與天然激素和神經遞質相同的效果，也不能假設阻斷其作用會完全消除這些信號。

隨著技術的進步，細胞功能學檢測已能識別和表征新型分子，例如偏向激動劑（選擇性穩定特定GPCR構象狀態，優先激活特定細胞內信號通路而犧牲其他通路）和變構調節劑（通過結合受體上除正構位點外的位點，影響GPCR與細胞內轉導分子的相互作用）。其結果之一是篩選命中率可能提高，因為對于變構配體，蛋白質的整個表面都可被視為潛在的有效結合位點。例如，GPR40上已發現三個分離的拮抗劑變構結合位點。此外，變構調節和偏向信號傳導均為開發候選藥物提供了機會，這些候選藥物的特性可能解決現有藥物針對已知靶點的局限性，或作用于此前未被開發的“禁忌”靶點。

為更有效地利用這些機會，本文首先總結苗頭化合物和先導化合物體外藥理學表征的關鍵方面，重點舉例說明過去和當前藥物開發項目中，此類知識已發揮或可能發揮價值的案例。隨后討論轉化為體內活性的挑戰，以及更復雜的藥理學分析在表征候選藥物療效、提高進入臨床試驗的候選藥物成功率方面的潛力。

體外藥理學表征

在初步篩選中確定具有合適特性、可進一步開發的苗頭化合物后，下一步是將這些化合物優化為先導化合物，并最終轉化為候選藥物。需要優化的特性眾多，其中一些與化合物對目標治療靶點的作用相關，另一些則涉及對其他蛋白質的影響，而為了降低安全風險，這類影響需盡量避免。還有一些特性對化合物的ADME（吸收、分布、代謝和排泄）特征至關重要。

本文的討論重點是與化合物對目標靶點作用相關的特性優化。但在實際研究中，多種特性的優化往往同步進行，且為解決某類特性（如安全性）的問題，可能需要在另一類特性（如效價）上做出妥協。

苗頭化合物和先導化合物的優化依賴于藥理學檢測，而檢測方法的性質對這一過程至關重要。綜合性檢測（即能捕捉受體與信號蛋白之間多種相互作用信息的檢測）相比僅關注單一相互作用的檢測（如放射性配體結合檢測或僅測量對環磷酸腺苷等單一第二信使影響的檢測），有潛力發現候選分子更多的效應。此外，改變檢測所監測的細胞內功能級聯反應的節點，也能提高檢測的靈敏度（級聯反應越下游，檢測涵蓋的范圍越廣，如下圖所示）。

針對GPCR靶點的化合物，其體外藥理學苗頭與先導化合物優化通常會研究四個特性：結合模式（正構或變構）、親和力、效能以及相互作用動力學。化合物的結合模式主要分為正構和變構兩種情況，二者最大的區別是前者會排除內源性配體的作用。親和力反映了與組織中受體結合的強度——具體而言，藥物對特定受體的親和力以Kd?1表示，其中Kd（平衡解離常數）是藥物-受體復合物的解離速率（koff）除以結合速率（kon）。

效能

效能則指的是靶點結合后觀察到的藥理效應是什么。比如PD-L1配體與其受體PD-1結合后，可以抑制T細胞功能。而藥物發現的主要目標便是獲得具有治療價值的候選分子。但候選藥物的效能本質往往僅從已知靶點特性的有限視角推斷。若靶點的信號傳導能力具有多效性，實際上許多靶點確實如此，則介導的藥理作用全部效應可能尚未被完全了解。

一個分子的治療價值可能源于其具備的一系列效能，而非單一活性。例如，理論上β受體阻滯對心力衰竭有益，但在16種測試的β受體阻滯劑中，僅有少數（其中卡維地洛效果最佳）顯示出真正的治療效能。這就引出一個問題：若不考慮藥代動力學差異，為何并非所有16種分子都對心力衰竭有效？其中一個解釋是β阻滯這一單一特性并非關鍵因素。卡維地洛的一系列效能（阻滯β2腎上腺素受體和α1腎上腺素受體、抗氧化作用、抗內皮素作用以及抗增殖特性）可能是關鍵，而非單一藥物特性。這些數據表明，候選藥物在體內傳遞的信號可能比之前認為的異質性高得多，因此盡可能識別候選分子的多種效能，對于解釋復雜體內研究中可能出現的令人困惑的數據非常有用。

然而，識別效能譜并理解其整體影響可能受限于測試時的可用技術。例如，1964年由詹姆斯?布萊克領導的帝國化學工業團隊發現的β受體阻滯劑普萘洛爾，可能是有史以來臨床測試最多的藥物。但在普萘洛爾被發現為β受體阻滯劑41年后，人們才發現它是ERK激酶激活劑，原因僅是此時相關檢測方法才出現。這強調了需要持續研究已知藥物，以了解其臨床效應是否部分源于此前未表征的活性。由此引申出一個結論：效能與用于測量它的檢測方法密切相關。因此，在任何給定檢測中未觀察到效能，未必表明不存在效能，可能只是使用了不合適的檢測方法。

與全面識別所需治療效能相關的是，早期識別導致副作用的不想要的效能。這類研究應與先導化合物優化研究并行開展，以避免陷入具有潛在缺陷的化學骨架。例如，若測試分子被證明對hERG鉀通道有活性，則在通過藥物化學手段從先導骨架中去除這一特性之前，繼續進行先導化合物優化毫無意義。

特定激動劑對不同信號通路的內在活性（即最大反應）正用于藥物開發。例如，TRV130的選擇性偏向性信號特征的一個重要部分是β抑制蛋白信號傳導（相對于G蛋白信號傳導）降低50%，這實質上減弱了該分子的β抑制蛋白反應。事實上，阿片受體的部分激動作用正被用于研究，以實現具有治療價值的阿片類鎮痛效果。這種方法也被用于新型GLP-1受體偏向激動劑（如替爾泊肽）的研究。GLP-1/GIP受體激動劑替爾泊肽在GIP受體上相對于β抑制蛋白2招募和環磷酸腺苷積累，偏向于ERK1/2磷酸化。研究表明，替爾泊肽減少β抑制蛋白招募，從而減少GLP-1受體脫敏和下調。目前，尚無足夠數據確定這些激動劑的良好治療特征是源于多受體激活還是偏向性信號傳導，但這些分子確實體現了復雜的多種效能在臨床中的影響。

與靶點相互作用的動力學特性

盡管體外實驗中會保持藥物濃度恒定以進行測量，但體內藥物濃度從未恒定，因此藥物在體內與靶點結合的持續時間，對候選藥物的整體治療效能和選擇性而言可能是非常重要的特征。

體外研究中，探索和優化候選藥物與靶點相互作用動力學的常用模型是“藥物-靶點駐留時間模型”。該模型的核心特征是：盡管體內藥物-靶點復合物的壽命由結合速率（kon）和解離速率（koff）共同決定，但在同一化學系列中，受擴散速率等影響kon的因素限制，實際上koff往往是關鍵決定因素。這種情況下，藥物-靶點駐留時間（定義為1/koff）可通過先導化合物優化階段的體外實驗簡單測量，從而助力實現理想的體內藥代動力學特征。

事實上，有案例表明治療效能更多依賴體內藥物-靶點復合物的壽命而非效價。例如血管緊張素II亞型1受體拮抗劑，藥物是否產生差異性或不可逆轉的阻滯作用，與藥物和受體的結合持續時間高度相關。

盡管體內藥物-靶點復合物的壽命通常與受體區域的藥物濃度相關，但當koff極慢時，藥效學與藥代動力學可能出現背離。此時，靶點區域的藥物存在與藥物反應會相互分離，藥物與受體結合產生的效應持續時間，會超過可觀測到的藥物清除時間。

體內藥代動力學-藥效學分離的例子如下圖所示。總體而言，與靶點共價結合的不可逆藥物具有這一特性，與靶點強結合的藥物也可能出現類似情況。例如，兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）抑制劑奧匹卡朋就表現出顯著的藥代動力學-藥效學分離：其血漿終末半衰期僅1.0-1.4小時，但因駐留時間長，奧匹卡朋誘導的COMT抑制半衰期超過100小時。通過不可逆清除靶點，如利用蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）降解靶蛋白，也可實現同樣的效果。

不過，kon也并非不重要，kon也可能是影響體內藥物-靶點復合物壽命的重要因素。在體內受限的受體結合區域，kon的差異可能極為重要。具體而言，由于kon是二級速率常數，若因擴散受限導致區域內配體濃度升高，配體濃度可增強kon的作用。這可能引發“受體再結合”現象，以koff速率從靶點解離的配體不會通過自由擴散離開區域，而是重新結合并占據受體。這會顯著延長體內藥物效應，使kon成為候選藥物表征的重要參數。

因此，測量kon和koff可共同表征候選分子的預期效應：當kon較慢時，koff起主導作用；而當kon較快時，kon可延長體內藥物-靶點復合物的壽命（受局部藥物濃度影響）。體內藥物-靶點復合物的最長壽命，源于選擇性區域相關的非競爭性行為（快kon+慢koff），而非簡單的競爭性行為（快kon+快koff或慢kon+快koff）。此外，快kon比慢kon更易引發受體再結合。這類動力學特征的重要性在治療精神分裂癥的多巴胺D2受體拮抗劑中得到充分證明：kon（而非koff）與靶點相關的錐體外系副作用相關。

體內活性研究

當一個分子被確定為具有開發潛力的先導化合物后，證明該分子能在體內與靶點發生真實作用就變得至關重要。體內分子評估包括研究藥物在靶點所在部位的存在情況、靶點結合與停留時間（可能與體外結合及停留時間不同）、有效性，以及更復雜的藥理學分析，以更清晰地界定候選藥物的療效。

靶點所在部位的藥物存在情況

這涉及研究藥物吸收和分布的藥代動力學特征（藥物能否到達體內合適區域），并確認藥物存在于靶點所在部位。在此階段，必須明確四個問題：1）給藥劑量中，有多少藥物被吸收？2）被吸收的藥物在體內分布于何處？3）藥物在體內能停留多久（清除情況）？4）需多久給藥一次才能達到血漿穩態濃度？目前已有可預測這些藥代動力學參數的低成本體外ADME測定方法，應用這些方法可降低臨床試驗中出現意外情況的風險。但對于候選新藥而言，理解藥代動力學參數及其對藥物在體內到達靶點過程的影響至關重要。

體內靶點結合與停留時間

藥物需在體內與治療靶點結合才能發揮作用。例如，若藥物體內半衰期長是由于分布容積極大，這種長半衰期并無實際意義——藥物可能被隔離在脂肪組織等部位，導致治療部位不存在藥物。在此階段，生物標志物十分重要，至少能表明藥物存在于體內且在組織中與靶點發生了結合。同樣關鍵的是，藥物與靶點的結合時間需與產生治療效果所需時間相匹配。如前文所述，這需要藥物具備良好的藥代動力學特征，且藥物-靶點復合物具有理想的解離速率（koff）和結合速率（kon）。

有效性

以療效為重點的臨床試驗（通常為II期）與以有效性為重點的臨床試驗（通常為III期）存在差異。療效試驗旨在確定藥物在人體中是否具有活性，為檢測這種活性，需使基線盡可能統一，通常通過選擇范圍狹窄的患者群體來實現。相比之下，有效性試驗在異質性更強的患者群體中開展，以確定藥物的真實治療效果——在這種情況下，信號可能會在較高的背景噪音中消失。這是一個更嚴格的標準，也是許多藥物研發失敗的節點。

因此，開展有效性試驗前需考慮的關鍵問題是：能否將靶點結合與藥物產生的治療性效應關聯起來？這往往是將新分子與人體預期治療效果聯系起來的過程中最困難，但也最關鍵的步驟。

mGlu5正性變構調節劑（PAM）激動劑VU0092273的研究，便是體現藥物存在、靶點結合與潛在治療效用關聯性的實例。利用mGlu5受體顯像劑1?F-FPEB標記小腦受體進行正電子發射斷層掃描（PET），隨后觀察到VU0092273對其產生置換作用，表明該分子能與大腦中被認為與抗精神病活性治療效應相關的區域（紋狀體和小腦）的受體發生相互作用。而其與潛在治療效用的關聯則體現在：VU0092273在體內靶點所在關鍵區域達到結合濃度時，也能產生與治療活性相符的效應。在該研究中，其可逆轉苯丙胺誘導的過度運動，這被視為抗精神病活性的替代指標。

明確候選藥物療效的藥理學分析

在特定功能測定中觀察到的藥物效應，可視為該藥物在特定系統組合中作用的“快照”。而藥物在體內的效應則應被看作一部完整的“電影”：藥物會在不同基礎活性和敏感性條件下接觸多個功能系統，這給體外效應向體內條件的有效轉化帶來了挑戰。

將藥理學原理應用于先導化合物優化過程，有助于評估候選新藥的潛在價值。藥理學能夠基于獨立于系統的參數來表征化學物質改變生理功能的能力，因此可預測藥物在多種組織中的體內治療效應。基于此，親和力、效能、α值（變構調節對親和力的影響）、β值（變構調節對效能的影響）等系統獨立參數，可用于藥理學模型（如Black/Leff操作模型、功能性變構模型）中，以預測候選藥物在不同組織中的活性。

例如，毒蕈堿受體PAM激動劑BQCA在不同敏感性組織中表現出不同特征，但可通過一組統一的分子活性參數進行建模，進而預測其在所有組織中的效應。具體而言，在三種敏感性不同的細胞系中，BQCA的作用存在差異：在一種細胞系中產生直接激動作用并增強乙酰膽堿的效應；在另一種細胞系中僅產生增強效應；在第三種細胞系中則增加乙酰膽堿的最大反應。但通過功能性變構模型（通過改變激動劑效能τA來設定不同的測定敏感性），這些不同表現均可通過一組系統獨立的變構參數擬合：α=12（對親和力的影響）、β=2（對效能的影響）、KB=5μM（親和力）、τB（調節劑的直接效能，以乙酰膽堿效能的百分比表示）=1.4%。此類結果使藥物化學家能專注于這組獨立參數，而無需擔心藥物性質在不同組織中的具體表現。

將體外藥物特征轉化為體內特征時，另一有用原則是盡可能使用分子活性指標，而非復雜的系統行為指標。例如，激動劑效價是公認的激動劑活性指標，但效價是親和力和效能兩種分子特性的綜合體現。具體而言，半數有效濃度（EC50，作為效價指標）是親和力與效能的比值；在操作模型中，EC50=KA/(τA+1)，其中KA為激動劑-受體復合物的平衡解離常數（親和力），τA為激動劑效能。

對選定為候選藥物的分子進行藥理學特性研究，是藥物研發過程中至關重要的一步，原因有二。其一，可深入了解疾病狀態、治療需求以及分子在臨床環境中的復雜行為。其二，能幫助項目團隊為首個候選分子的失敗做好準備。具體而言，若候選分子失敗，可推進后續分子以挽救研發工作；同時，了解失敗分子的一系列效能特征，有助于規避陷阱，避免后續分子重蹈覆轍，出現與失敗分子相同的特性。

以下列舉幾個真實的化合物藥理學特征分析案例，說明體外活性向體內活性轉化過程中可能出現的解讀偏差，以及如何規避這些偏差。

案例1：組胺H2受體阻滯劑長期用于潰瘍治療后失效

組胺H2受體阻滯劑在急性期可減少胃酸分泌并促進潰瘍愈合，但研究發現部分H2阻滯劑在長期治療后會喪失活性，這歸因于H2受體在細胞表面的表達增加。這種失活現象在反向激動劑中出現，而在中性拮抗劑中未觀察到。原因在于：盡管細胞持續合成受體，但反向激動劑會抑制細胞表面受體的活化（以及隨后正常的受體內化）；而中性拮抗劑不會阻止受體的自發活化，也不會抑制受體內化。該案例表明，確定候選拮抗劑是否為反向激動劑具有重要價值。盡管并非所有反向激動劑都會產生耐受性，但了解這種可能性對分子的體內測試具有指導意義。

案例2：CCR5內化劑抗HIV-1感染活性失效（真實案例）

HIV-1通過與趨化因子受體CCR5相互作用感染細胞，因此CCR5內化是降低HIV-1感染的潛在機制。趨化因子可介導CCR5內化，但內化過程的結果存在差異。例如，趨化因子CCL5可快速介導受體內化，但受體隨后會迅速循環回細胞表面，因此CCL5對HIV-1感染幾乎無抑制作用；而另一種趨化因子AOP-RANTES可介導受體內化并將其導向細胞降解途徑，從而阻止受體重新回到細胞表面。該案例表明，在生化測定中進一步表征內化受體的處置情況、闡明受體內化機制具有重要價值。

案例3：偏向性血管緊張素受體調節劑治療心力衰竭失敗（真實案例）

當藥物具有多種精細調節的效能時，若臨床試驗未以正確結果為目標，就可能喪失其獨特活性。TRV027（一種用于心力衰竭研究的偏向性血管緊張素II1型受體調節劑）的研發失敗便是典型例子。在針對急性心力衰竭患者的IIb期隨機、雙盲、安慰劑對照劑量遞增試驗（BLAST-AHF）中，TRV027未顯示出優越的療效，這體現了偏向性從體外向體內轉化的困難。盡管TRV027主要是血管緊張素受體拮抗劑（與已獲批的心力衰竭藥物氯沙坦類似），但其還具有額外效能（β-抑制蛋白激動作用），旨在數月內增強有益的心臟重構。然而，該試驗設計為短期（48-96小時）輸注TRV027，終點為評估30天后對癥狀和生存率的影響——這種設計無法檢測到TRV027的獨特活性。此外，患者群體的腎素-血管緊張素活性似乎未充分升高，這使得血管緊張素受體拮抗劑的任何益處都難以在這種陰性背景下顯現。該案例說明，對特性略有差異的候選分子進行臨床評估時，可能需要更高的敏銳度才能識別其獨特價值。