AFM丨葛廣波、郭兆彬團隊：新型血管化肺癌類器官芯片助力抗轉移藥物精準評價

近日， 上海中醫藥大學葛廣波研究員、郭兆彬青年研究員團隊與澳大利亞南澳大學Chih-Tsung Yang研究員團隊合作，在國際期刊Advanced Functional Materials發表題為A Vascularized Lung Tumoroid-on-a-Chip Model for the Accurate Assessment of Anti-Invasion Agents的研究論文。該研究成功構建了一種新型血管化肺癌類器官芯片平臺，實現了對腫瘤-血管交互作用的動態可視化與精準量化，為抗非小細胞肺癌轉移藥物篩選與機制研究提供了強有力的工具。現將其研究背景、核心發現及學術貢獻作一梳理介紹。

肺癌是全球癌癥相關死亡的首要原因，其中非小細胞肺癌占比超過 85% ，其五年生存率僅約 5% 。腫瘤轉移是導致患者死亡的核心原因，也是臨床治療失敗的主要因素。然而，目前抗轉移藥物研發面臨一個關鍵瓶頸：缺乏能夠精準模擬腫瘤 - 血管交互、動態再現轉移關鍵事件的臨床前模型。傳統模型存在三大局限：一是二維劃痕或 Transwell 法無法實現腫瘤細胞與血管內皮細胞的直接三維接觸；二是動物模型難以在單細胞水平實時觀測腫瘤細胞與血管的動態互作；三是替代性血管化過程 —— 包括 血管嵌合體 、血管生成擬態及血管共定位等 —— 因缺乏可視化模型而長期被忽視。而恰恰是這些非經典血管化途徑，構成了腫瘤逃避抗血管生成治療的重要耐藥機制。針對這一科學問題，研究團隊自主研發了血管化肺癌類器官芯片模型，成功實現了對血管嵌合體形成過程的實時追蹤與定量分析。

1） 血管化肺癌類器官芯片模型的構建與功能驗證

研究團隊采用預埋鎳鈦絲 - 膠原凝膠 - 內皮化灌注策略，在聚二甲基硅氧烷（ PDMS ）微流控芯片中構建了直徑 220 μm 、襯有人臍靜脈內皮細胞的單層可灌注微血管。將預先形成的肺癌類器官（ A549 、 H460 及患者來源循環腫瘤細胞株 CTC-TJH-01 ）分散于 I 型膠原溶液中，注入芯片腔室，待膠原凝膠化后拔出鎳鈦絲形成中空通道，隨后接種 HUVECs 并在持續灌注條件下建立完整、具備屏障功能的微血管。該配置實現了腫瘤類器官與內皮細胞的直接三維接觸，灌注剪切力為 4 dynes/cm2 ，模擬毛細血管后微靜脈生理環境。

實驗結果表明，三株肺癌細胞系形成的類器官在芯片內呈現相近的生長動力學， 5 天內相對生長面積無統計學差異。腫瘤類器官與內皮細胞共培養組與無內皮對照組相比，類器官生長速率無顯著差異，且類器官初始面積（ 20000–80000 μm2 范圍內）及與血管距離均與生長速率無相關性，證實模型具備良好的穩定性和可重復性。

為評估微血管屏障完整性及腫瘤誘導的屏障破壞，研究團隊在血管內皮化后第 2 天向管腔內灌注分子量 70 kDa 的異硫氰酸熒光素標記葡聚糖，該分子量與人血清白蛋白相當。熒光成像及通透系數定量顯示，不含腫瘤類器官的空白芯片中微血管屏障功能完好， FITC- 葡聚糖滲漏極微；而含腫瘤類器官的 VLTOC 芯片中， FITC- 葡聚糖向膠原凝膠擴散顯著增加，即使遠離腫瘤 - 血管直接接觸區域的血管段亦呈現明顯滲漏。定量分析顯示，含腫瘤組血管通透系數較空白組升高約 2 倍，差異具有統計學意義。該結果表明，腫瘤類器官可通過旁分泌或間接機制破壞微血管屏障功能，成功復現腫瘤相關血管的增強滲透與滯留效應。

2）VLTOC 模型轉錄組學特征揭示惡性進展相關通路顯著富集

為解析 VLTOC 模型中腫瘤細胞的分子表型特征，研究團隊對 VLTOC 培養的 A549 細胞、常規三維腫瘤球體及二維培養細胞進行 RNA 測序及比較轉錄組學分析。主成分分析顯示， VLTOC 樣本與 3D 球體樣本呈現顯著的轉錄譜分離，提示 VLTOC 微環境驅動了腫瘤細胞深度的轉錄重塑。

差異表達基因分析顯示，與 3D 球體相比， VLTOC 中顯著上調基因 2953 個，顯著下調基因 2830 個。功能注釋表明，上調基因顯著富集于腫瘤代謝、增殖、轉移及血管生成等關鍵惡性進程相關功能模塊。具體基因層面，代謝相關基因 PRR11 、 CDK1 、 CDK2 ，增殖標志基因 MKI67 、 CCN2 、 ABLIM2 ，侵襲轉移相關基因 FLT1 、 MMP1 、 MMP2 ，血管生成相關基因 CD93 、 ESM1 、 ANGPT2 等在 VLTOC 中均呈現顯著高表達。

WikiPathways 通路富集分析進一步揭示，相較于 3D 球體， VLTOC 模型中腫瘤相關通路顯著富集，包括線粒體復合物 II 組裝、 IL-24 信號通路、 VEGFR2 介導信號級聯等。基因集富集分析顯示，細胞周期、 IL-24 信號、 VEGFA-VEGFR2 信號通路在 VLTOC 中顯著上調。上述結果共同表明， VLTOC 模型中的腫瘤細胞呈現代謝重編程、增殖能力增強、血管生成活性及侵襲潛能升高的表型特征，與臨床腫瘤惡性進展的關鍵標志高度吻合。

3） 血管嵌合體形成過程的動態可視化與量化分析

血管嵌合體指內皮細胞部分被腫瘤細胞替代、形成腫瘤細胞 - 內皮細胞混雜共構的血管壁結構，該形態與腫瘤患者不良預后密切相關，但長期缺乏可動態觀測的體外模型。

本研究通過共聚焦三維重建及免疫熒光染色，首次在芯片模型中清晰捕獲 血管嵌合體 的立體結構。 XY 、 YZ 、 XZ 三軸斷層掃描顯示，紅色熒光標記的 A549 腫瘤細胞嵌入綠色熒光標記的 HUVEC 單層，向血管腔內突起，形成典型鑲嵌形態。 VLTOC 切片免疫熒光染色進一步確認 血管嵌合體 結構： Ki67 陽性腫瘤細胞簇占據 CD31 陽性內皮層間隙，該形態特征與裸鼠移植瘤組織切片的免疫熒光染色結果高度一致。值得注意的是， 血管嵌合體 區域的內皮細胞亦呈現 Ki67 陽性，提示其獲得增殖性腫瘤相關內皮表型； MMP2 在腫瘤細胞與內皮細胞中均有共表達，提示內皮細胞發生表型轉化，獲得促基質重塑及促侵襲能力。

為表征 血管嵌合體 生長動力學，研究團隊以首次檢出 血管嵌合體 的時間點為 M0 ，進行每日連續成像追蹤。結果顯示， 血管嵌合體 形成后前兩日內擴張加速，表現為腫瘤細胞沿血管壁縱向擴展、內皮層缺損進行性擴大。定量統計表明， 31% 的血管旁腫瘤類器官形成 血管嵌合體 ，其中 71% 的 血管嵌合體 事件發生于內皮化后 2 天內，第 2 天達發生率峰值。三株細胞系中， A549 來源類器官呈現最高的 血管嵌合體 發生率及第 5 天最大擴張面積。內皮細胞存在與否的對比實驗顯示，無內皮襯覆通道中腫瘤類器官對中空通道的侵入率及侵入面積均顯著高于內皮化通道，證實完整內皮屏障對腫瘤侵襲及 血管嵌合體 起始具有抑制性調控作用。

4）細胞骨架重塑是驅動 血管嵌合體 形成與進展的關鍵機制

為解析 血管嵌合體 形成的分子驅動機制，研究團隊整合轉錄組學分析與功能驗證實驗。基因集富集分析顯示，相較于 3D 球體模型， VLTOC 模型中微管骨架調控通路顯著富集， CDK1 、 KIF2C 、 STMN1 、 AURKB 等微管動態相關基因顯著上調； F- 肌動蛋白相關通路未達統計學顯著水平。

免疫熒光染色對轉錄組發現進行蛋白水平驗證。結果顯示， VLTOC 中微管蛋白熒光強度較 3D 球體顯著升高， F- 肌動蛋白熒光強度亦呈現顯著上調，與轉錄組數據部分差異可能源于轉錄 - 翻譯事件的時間滯后。該結果支持細胞骨架動態重構可能是腫瘤侵襲與 血管嵌合體 形態發生的匯聚機制。

為功能驗證該假說，研究團隊通過血管腔內灌注途徑分別給予微管聚合抑制劑 tubulin inhibitor 6 、 F- 肌動蛋白裝配抑制劑 Cytochalasin D 、 Rho 激酶通路抑制劑 Y-27632 。三類抑制劑處理均未對腫瘤類器官增殖活性及細胞活力產生顯著影響，但均顯著抑制 血管嵌合體 的發生與擴張。其中， F- 肌動蛋白抑制幾乎完全阻斷 血管嵌合體 形成； ROCK 通路阻斷 —— 作為細胞骨架收縮性的關鍵調控節點 —— 顯著削弱 血管嵌合體 的起始與進展。上述結果共同確立細胞骨架動態重塑作為 血管嵌合體 形成及腫瘤相關血管共選的關鍵驅動力。

5） 基于腫瘤生長、血管嵌合體動力學及健康微血管損傷的三維度藥效評價體系建立

為驗證 VLTOC 模型在藥物測試中的臨床轉化價值，研究團隊選取 5 種臨床獲批的非小細胞肺癌化療藥物 —— 紫杉醇、順鉑、伊立替康、奧沙利鉑、吉西他濱 —— 進行系統評估。采用基于單層培養 A549 細胞 IC50 幾何均值（約 140 nM ）的標準化給藥劑量 100 nM ，通過持續血管腔灌注給藥，對腫瘤類器官增殖、 血管嵌合體 動力學、健康微血管屏障完整性進行并行量化。

腫瘤類器官生長追蹤顯示，紫杉醇與吉西他濱對腫瘤類器官增殖呈現顯著抑制作用，而順鉑、伊立替康、奧沙利鉑在 100 nM 劑量下未顯示統計學顯著的腫瘤生長抑制效應。

血管嵌合體 動力學分析顯示，紫杉醇與吉西他濱顯著降低 血管嵌合體 發生率及擴張速率；伊立替濱選擇性抑制 血管嵌合體 擴張速率而不影響發生率；順鉑與奧沙利鉑對兩項指標均無顯著調節作用。

針對化療藥物脫靶血管毒性，研究團隊在無腫瘤類器官的健康微血管模型中評價藥物對血管屏障功能的損害。除奧沙利鉑外，其余 4 種化療藥物處理均導致 FITC- 葡聚糖外滲顯著增加，血管通透系數較對照組顯著升高，表明治療劑量的紫杉醇、順鉑、伊立替康、吉西他濱可對健康脈管系統造成脫靶損傷，而奧沙利鉑在所測試化療藥物中呈現最佳血管安全性。該結果與臨床報道的化療相關血管毒性譜系高度一致。

6） 血管嵌合體擴張速率與 TCGA 藥物敏感性預測呈現強相關性

為評估 VLTOC 模型的藥物篩選預測準確性，研究團隊基于癌癥基因組圖譜肺腺癌隊列數據， 采用 Onco-predict 機器學習算法對 5 種化療藥物的敏感性進行預測，并與 VLTOC 實測結果進行系統比較。

通過單變量回歸及 LASSO 回歸遞進分析，從 VLTOC 差異表達基因中篩選出 112 個與 TCGA 肺腺癌患者生存不良相關的候選特征，進一步經多變量回歸鑒定出 11 個基因作為獨立預后風險因子，包括 FAM83A 等既往報道經 HIF-1α/ 糖酵解軸促進肺癌侵襲的關鍵分子。功能注釋顯示，該 11 基因集主要參與腫瘤代謝調控、活性氧穩態及微小 RNA 調控網絡。

基于 11 基因構建的預后列線圖成功將 TCGA 患者劃分為高風險組與低風險組， Kaplan-Meier 生存分析證實高風險組患者生存概率顯著低于低風險組，時間依賴性受試者工作特征曲線顯示 1 年、 3 年、 5 年生存預測的曲線下面積分別為 0.82 、 0.75 、 0.71 ，預測效能良好。

基于該 11 基因特征集，研究團隊采用 Onco-predict 算法計算 5 種化療藥物的敏感性評分，并與 VLTOC 實測的腫瘤生長抑制率及血管嵌合體擴張抑制率進行相關性分析。結果顯示，藥物敏感性預測評分與腫瘤生長抑制率呈中等程度相關，未達統計學顯著水平；而與血管嵌合體擴張抑制率呈現強相關性， Pearson 相關系數 r=0.9828 ， P=0.0027 。該結果表明，血管嵌合體擴張速率相較于傳統腫瘤生長指標，是與臨床藥物敏感性更具預測一致性的量化指標，確立其作為抗腫瘤轉移藥物療效評價核心指標的價值。

7） 中藥藥效物質 楝酰胺在 VLTOC 模型中呈現抗侵襲、低血管毒性、促免疫粘附三重藥理特征

為進一步驗證 VLTOC 平臺對候選化合物藥效及作用機制的預測能力，研究團隊選擇來源于楝科植物的天然活性成分楝酰胺（ RocA ）作為驗證對象。 RocA 既往報道具有抗非小細胞肺癌活性，但其對腫瘤 - 血管交互及血管嵌合體形成的影響尚未闡明。

基于二維細胞毒性與劃痕遷移實驗，確定 RocA 對 A549 細胞的 IC50 為 88.6 nM ， 100 nM 劑量下顯著抑制細胞遷移。據此在 VLTOC 模型中設置 100 nM 、 50 nM 、 20 nM 三個給藥劑量。結果顯示， RocA 呈劑量依賴性抑制腫瘤類器官生長， 50 nM 及以上劑量對血管嵌合體發生率及擴張速率均呈現顯著抑制效應。值得注意的是，與紫杉醇、吉西他濱、伊立替康等傳統化療藥物不同， RocA 在 100 nM 有效抗腫瘤劑量下未對微血管屏障完整性造成顯著損傷，血管通透系數與對照組無統計學差異，提示其具備潛在的治療窗口優勢。

為解析 RocA 在 VLTOC 模型中的分子機制，研究團隊對 100 nM RocA 處理 24 小時的 VLTOC 樣本進行轉錄組測序。差異表達基因分析鑒定出 237 個顯著變化基因，通路富集分析顯示 II 型干擾素信號、 TWEAK 信號通路、 TNFα 信號通路等免疫調控相關通路在 RocA 處理組顯著激活，與既往報道 RocA 通過 cGAS-STING 通路激活非小細胞肺癌中 NK 細胞浸潤、增強抗腫瘤免疫的發現高度一致。

為定量評估 RocA 的免疫調節效應，研究團隊在 VLTOC 平臺中建立流動免疫細胞粘附實驗體系。經 RocA 預處理 48 小時后，將熒光標記的 THP-1 單核細胞以 10?/mL 濃度在生理剪切應力下灌注通過微血管腔 10 分鐘，隨后以新鮮培養基持續灌注 15 分鐘洗去非粘附細胞。定量分析顯示， RocA 處理組微血管壁粘附 THP-1 細胞密度較對照組顯著升高。在 4 dynes/cm2 生理剪切應力下持續灌注 24 小時后， RocA 處理組仍維持顯著更高的 THP-1 滯留比例。該結果從功能層面證實 RocA 促進免疫細胞與腫瘤血管壁的穩定粘附，為 RocA 聯合免疫治療的潛在應用提供實驗依據。

8）VLTOC 模型藥效觀察與動物模型平行驗證呈現高度一致性

為評估 VLTOC 模型藥效數據的體內轉化一致性，研究團隊構建 A549 裸鼠皮下移植瘤模型，系統研究 RocA 的抗腫瘤療效與系統毒性。荷瘤小鼠隨機分為兩組，治療組每 48 小時腹腔注射 RocA 2 mg/kg ，對照組給予等體積溶媒，連續給藥 14 天。

長期腫瘤體積追蹤顯示， RocA 治療組自給藥第 8 天起腫瘤體積增長顯著緩于對照組，終點腫瘤體積及瘤重均顯著低于對照組。腫瘤組織 HE 染色顯示，對照組腫瘤細胞核形態保存、胞質結構完整， RocA 治療組腫瘤組織呈現廣泛空泡化 —— 細胞損傷典型形態學標志。 Ki67 免疫組化染色定量證實 RocA 治療組腫瘤細胞增殖活性顯著受抑。

為表征血管嵌合體在動物模型中的存在及 RocA 的干預效應，研究團隊對腫瘤組織切片進行 CD31/Ki67 及 CD31/TTF-1 雙重免疫熒光染色。共定位分析顯示，對照組腫瘤組織中存在 CD31 陽性內皮層被 Ki67 陽性或 TTF-1 陽性腫瘤細胞簇占據的血管嵌合體結構， RocA 治療組血管嵌合體占所有血管樣結構的比例顯著下降。該結果與 VLTOC 模型觀測到的 RocA 抑制血管嵌合體發生率及擴張速率高度吻合。

腫瘤組織 CD45 免疫組織化學染色顯示， RocA 治療組腫瘤內白細胞浸潤面積顯著高于對照組，提示 RocA 促進腫瘤免疫浸潤，與 VLTOC 中 THP-1 粘附增加的功能實驗結果相互印證。主要臟器 HE 染色顯示，心、肝、脾、肺、腎組織形態在兩組間未見明顯差異，核仁結構保存、無病理空泡化，提示 RocA 在有效劑量下未造成顯著器官毒性。

上述動物模型數據與 VLTOC 平臺在抗腫瘤增殖、抑制血管嵌合體、維持血管完整性、促進免疫粘附等維度的觀測結果呈現高度一致性，系統驗證了 VLTOC 模型的體內轉化預測效能。

本研究構建了血管化肺癌類器官芯片平臺，并建立了基于腫瘤生長、血管嵌合體動力學、健康血管損傷三維度的藥效評價體系，取得以下進展：

模型創新層面，在體外實現血管嵌合體形成過程的動態可視化與單細胞分辨率實時追蹤，填補了替代性血管化體外模型的長期空白。該平臺采用膠原基質三維共培養、生理剪切力灌注、患者來源細胞整合等設計要素，在腫瘤 - 血管交互復現度與定量可控性方面較傳統模型形成本質提升。

機制發現層面，整合轉錄組學、蛋白水平驗證與功能干預實驗，確立細胞骨架動態重塑作為血管嵌合體起始與進展的核心驅動力。該發現將細胞骨架調控從腫瘤細胞內在遷移能力的經典范疇拓展至腫瘤 - 血管結構重構的新型功能維度。

方法學層面，建立以血管嵌合體擴張速率為核心指標的抗轉移藥效評價方法。基于 5 種臨床化療藥物及 TCGA 機器學習藥物敏感性預測的關聯分析顯示，血管嵌合體擴張抑制率與臨床藥物敏感性預測評分的相關性顯著強于傳統腫瘤生長抑制指標。該發現將血管嵌合體動力學確立為兼具機制關聯性與臨床轉化預測價值的藥效量化指標。

轉化驗證層面，通過臨床化療藥物、候選天然產物、患者數據機器學習預測、動物模型平行驗證的四級驗證體系，系統論證了 VLTOC 平臺的藥物篩選效能與臨床預測一致性。楝酰胺在芯片 - 動物雙模型中呈現抗侵襲、低血管毒性、促免疫粘附的三重藥理特征，為靶向替代性血管化的抗轉移策略提供了候選分子與驗證范式。

本研究為抗腫瘤轉移藥物研發提供了兼具生理相關性、動態可視化、多維量化能力的新型評價工具，將替代性血管化 —— 這一長期處于研究視野邊緣的耐藥機制 —— 納入可控、可測、可篩的體外研究體系，為后續靶向腫瘤 - 血管交互的抗轉移策略開發奠定了方法學基礎。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202526981

制版人：十一

BioArt

Med

Plants

人才招聘

學術合作組織

（*排名不分先后）

轉載須知

【非原創文章】本文著作權歸文章作者所有，歡迎個人轉發分享，未經作者的允許禁止轉載，作者擁有所有法定權利，違者必究。