J Biol Chem丨叢羽生團隊梁千合作在猶素化修飾（UFMylation）方法優化與底物鑒定取得重要進展

泛素（Ubiquitin）及類泛素（Ubiquitin-like，UBL）蛋白介導的翻譯后修飾，是調控細胞生命活動的核心分子機制之一。 猶素 UFM1 （ U biquitin F old M odifier 1 ）作為UBL家族的 一員 ，擁有與泛素及其他類泛素蛋白相似的三維結構、折疊模式及酶促反應特征，其介導的翻譯后修飾被稱為 猶素化修飾 （ UFMylation ）。猶素化修飾的發生依賴于UBA5–UFC1–UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3構成的E1–E2–E3級聯反應， 將 UFM1共價連接 至 底物蛋白 的賴氨酸殘基上，而這一修飾可被猶素化修飾特異性蛋白酶UFSP1/2可逆性去除 （ de- UFMylation ） 。作為翻譯后修飾，猶素化修飾的生物學功能依賴于對底物蛋白的調控得以實現 。猶素化 修飾 的 失調與 腫瘤 發生、發育缺陷等多種疾病密切相關，是近年來分子生物學領域的研究熱點之一。

然而，猶素化修飾的功能機制研究長期受限于一個關鍵瓶頸：已鑒定并開展功能 研究 的底物蛋白數量極少。目前，已明確的猶素化修飾底物不足30個，遠 少于 泛素化、SUMO化等類泛素修飾系統。這一困境的形成主要源于 兩個因素 ：一是核糖體蛋白RPL26 是 細胞內最主要的底物，高豐度的RPL26 - UFM1綴合物 顯著 干擾 相對 低豐度底物的檢測；二是缺乏高效、特異的底物鑒定方法，難以捕捉到低豐度且動態變化的修飾底物。

為破解這一研究瓶頸，推動猶素化修飾領域的發展，近日，杭州師范大學叢羽生教授團隊梁千博士與杭州微米生物合作（第一作者為碩士研究生方瑤瑤）在 Journal of Biological Chemistry 雜志在線發表了題為 Optimization of protein UFMylation modification method and its application in substrate identification in human cells 的研究論文， 通過創新技術體系構建與優化，成功實現了猶素化修飾底物的大規模、高特異性鑒定，為該領域研究開辟了新路徑。

早在2022年 ，叢羽生教授團隊發現：人源UFSP1可通過上游 “ 近同源啟動子（CUG） ” 起始翻譯，其產物是具有完整催化活性和底物特異性的猶素化修飾蛋白酶，相關成果還入選了 Journal of Biological Chemistry 期刊的 Editors' Picks （jbc.2022.102016）。基于這一發現，團隊進一步探索，成功構建了 猶素化 修飾完全阻斷的UFSP1/UFSP2雙基因敲除（ UFSP1 KO /UFSP2 KO , DKO）人源HEK293T細胞株。 該 DKO細胞模型的優勢十分顯著：在細胞中，UFM1前體（85 aa ）無法被加工為成熟的UFM1?C2（83 aa ），導致內源性猶素化修飾完全阻斷；而當向該細胞中外源轉入活化型UFM1?C2后，細胞內原本完整的E1–E2–E3級聯酶系可正常催化猶素化修飾發生，同時由于缺乏UFSP1/2蛋白酶的去修飾作用， 底物 - UFM1綴合物 能夠大量積累，有效解決了低豐度底物信號被掩蓋的難題，為后續底物鑒定提供了理想的實驗模型。

團隊以三種已知底物 （ ASC1、RPL26、p53 ） 為對象 ，對比驗證了該細胞模型的高效性 證實雙敲除細胞為最優模型 。 隨后通過 單因素實驗 明確UFL1和DDRGK1為核心調控因子， 優化外源 轉染體系并提升實驗效率。 然后， 依托該優化體系，團隊聯合杭州微米生物 （提供 K-ε-GV特異性抗體與LC-MS/MS技術 支持） ，成功鑒定出 超 600個猶素化 修飾 底物，遠超既往研究總和，破解底物稀缺瓶頸。

猶素化修飾底物鑒定策略圖（方瑤瑤、梁千繪制）

團隊通過已知底物比對、新底物實驗驗證雙重手段，充分佐證了鑒定數據的可靠性。此外，研究還對修飾肽段的基序特征開展了系統分析，為后續猶素化位點預測工具的開發提供了理論基礎；亞細胞定位與功能注釋結果顯示，新鑒定的底物主要分布于細胞質和細胞膜，廣泛參與蛋白質翻譯、核糖體合成等關鍵細胞通路，為深入探究猶素化修飾的生物學功能指明了方向。 綜上， 該研究建立了一種更加高效、特異且可靠的UFMylation底物研究策略，為深入解析UFMylation的生物學功能及其調控機制提供了有力支撐。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2026.111320

制版人：十一

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