GLP一般毒理研究試驗方案的組成

本文介紹下GLP一般毒理研究（如單次和多次給藥毒性試驗）試驗方案的組成。主要參考《A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development》一書中的第6章節。

1. 遵守良好實驗室規范（GLP）聲明

所有用于評估藥物安全性的一般毒理研究（單次和多次給藥毒性試驗）都應在GLP條件下進行。當然，不僅一般毒理研究，生殖毒性（Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段）、致癌性、遺傳毒性（如Ames、染色體畸變和小鼠淋巴瘤試驗）、局部毒性試驗、免疫原性試驗、安全藥理學試驗、依賴性試驗、毒代動力學試驗等均需要在GLP認證通過的機構開展。所以，在試驗方案中需要包含GLP依從性聲明。這點看似普通，直至現在，依然有企業在這塊吃虧。有的企業，最初申報IND時，僅計劃在國內開展臨床研究，故方案中參照的GLP法規僅體現了NMPA《藥物非臨床研究質量管理規范》，后期開發過程中，想用該數據申報美國或其它法規國家，因方案中未聲明遵守目標國家的GLP法規情況，遭到拒絕。

2. 計算機化系統

用于數據生成、測量或評估的計算機化系統，應按照符合GLP原則的方式進行開發、驗證、操作和維護。

3. 委托方信息、研究機構信息、專題名稱、研究目標

方案中應體現委托方、GLP機構、專題名稱、專題代號等信息。

研究目標：根據產品具體適應癥和類型，一般毒理研究的目標有很多，比如確定“未觀察到不良效應水平（NOAEL）”；描述重復給藥后的劑量-效應關系；確定并描述重復給藥后受影響的特定靶器官、恢復情況；為更長周期重復給藥毒理研究提供劑量設計依據。

4. 受試物

毒性研究中使用的受試物應是申請人計劃在人體臨床試驗中使用的同一物質。如果可能，整個研究應使用同一批次的受試物。如果單一批次無法完成研究，則應使用純度和組成相似的批次。

關于這點，大部分企業會選擇制備兩批次樣品，一批non-GMP毒理批樣品，一批GMP臨床批樣品，顧名思義，前者主要用于支持非臨床毒理研究的開展，后者則用于臨床試驗。當然，兩批次樣品質量肯定要具備可比性的。

5. 鑒別、組成和純度

應明確受試物的鑒別、組成和純度，包括所有主要成分的名稱和含量、已知雜質和污染物以及不可識別成分的百分比。

6. 儲存條件和有效期

受試樣品應儲存在能夠維持其穩定的條件下，直至研究完成。受試物的有效期應明確，不得使用超過有效期的受試物。

7. 試驗系統和飼養管理

對于大多數藥品，通常需要兩種種屬進行毒理研究：嚙齒類動物和非嚙齒類動物。

大多數國家都有關于動物的護理、維護和飼養的建議和法律要求，這些要求在所有GLP中都被明確規定。

以下是一些關于研究中動物使用方面的國際政府法規/指南的簡要列表：

美國國立衛生研究院（NIH）出版物85e23，《實驗動物護理和使用指南》

《實驗動物護理和使用指南》第八版（NRC 2011）

歐洲保護用于實驗和其他科學目的的脊椎動物公約：ETS 123附錄A；關于用于科學目的的動物保護的指令2010/63/EU

日本科學委員會2006年6月1日發布的《動物實驗正確操作指南》

動物福利法7 Usc 2131等（PL 89e544，1966年8月24日；修正案PL 91e579，1970年12月24日；修正案PL 94e279，1976年4月22日；修正案PL 99e198，1985年12月23日）

8. 物種、品系、性別和數量的選擇

試驗方案中應給出物種、品系、性別和動物數量選擇的理由。

如果研究中僅使用一種性別，則應根據預期的臨床用途或既往數據進行合理說明。在大多數毒理研究中，應同時使用雄性和雌性動物。

所有試驗動物必須健康，且未接受過任何的事先實驗操作。

9. 動物年齡和標識

在嚙齒類動物中，毒理試驗通常從6到8周齡開始。在非嚙齒類動物中，毒理試驗通常在動物接近性成熟時開始（非人靈長類動物除外）。NMPA《重復給藥毒性研究技術指導原則》明確規定，應根據試驗期限和臨床擬用人群確定動物年齡，一般大鼠為6～9周齡，Beagle犬6～12月齡，猴3～5歲，動物年齡應盡量接近，應注明開始給藥時動物年齡。關于猴年齡問題，FDA申報資料中低于3歲的動物用于一般毒理研究并不罕見，但國內監管機構對這一細節更加關注，前幾年也因為使用低年齡段動物，出現過風波，所以現在各機構已經很注意動物年齡的合規性。

試驗動物應進行個體標識，其飼養環境也應標明其物種、品系（和亞品系）、性別、年齡和唯一標識號碼（例如耳標、植入式標識芯片和動物紋身標識）。

10. 動物隨機化

動物應以分層隨機的方式分配到對照組和供試品組，以盡量減少偏差，并確保供試品處理組和對照組之間相關變量的可比性（如平均體重和體重范圍）。

如果使用其他特征作為隨機化的依據，則應進行描述和合理說明。

盡可能在同一天將動物納入研究。如果動物數量過多而無法在一天內完成分配，則可以在幾天內分批將動物納入研究，但每天應將相等比例的對照動物和實驗動物納入研究，以保持同時性。

11. 基礎飲食

在毒理研究中，應為動物提供自由采食和飲水，且這些研究的飼料應滿足物種正常生長和繁殖的營養需求。

除非有特殊情況需要其他安排，否則應確保受試物處理組動物的飼料與對照組動物的飼料具有相同的熱量密度，并且含有相同水平的營養成分（例如纖維、微量營養素）。

12. 對照組和供試品組

需要設置一個與受試動物同時進行的對照組。

應給予對照動物與受試物相同的載體或溶劑，其體積應與任何給藥組動物所接受的最大載體或溶劑體積相等。

應有足夠的毒理學信息來確保所使用的載體或溶劑不會影響研究結果。如果關于用于施用受試物的載體或溶劑的毒性信息不足，則應增加一個未暴露于載體或溶劑的額外對照組。

其他方面，對照組動物應與給藥組動物接受相同的處理。

至少應設置三個劑量水平（加上同時進行的對照組），給藥途徑應與人體預期暴露途徑相同，最低劑量應無明顯毒性，最高劑量應產生明顯的毒性，表現為以下情況：

死亡或發病（不推薦作為終點，但可以使用）；飼料消耗量變化；體重變化；毒性體征；臨床病理學；組織病理學

13. 恢復期組

在至少一項毒理學研究中，通常需要進行恢復期評估，即在給藥階段結束后增加一個非暴露期，專門用于確定任何與受試物相關的毒理發現的潛在可逆性。

14. 給藥途徑和持續時間

受試物的給藥途徑應盡可能接近人體正常暴露途徑。如果使用其他途徑，則應提供理由。在整個研究中，所有試驗動物應使用相同的給藥方法。

除非有藥理學證據表明每日給藥并無必要，或者這不是人體預期給藥方案（如某些生物藥物半衰期長，給藥間隔久），否則動物應每日暴露于受試物。

給藥周期視臨床擬用方案而定，具體可參見ICH M3。

15. 體重和飼料攝入數據

試驗動物每周至少稱重一次。

在亞慢性毒性研究期間，每周應測量飼料消耗量（如果受試物通過飲用水給藥，則測量飲水量）。

16. 臨床觀察

應進行眼科檢查、血液學分析、臨床生化檢測和尿液分析。不曉得為什么該書會將這些指標納入Clinical Observations，尊重原作，保留原文內容（下文會逐一介紹）。不過，除了以上指標，體溫、血壓、心電圖等也是常規毒理檢測終點指標，正常情況下，在方案中也要體現。

17. 毒代動力學

應進行系統暴露評估，以確認給藥劑量與血藥濃度的關系，評估劑量比例關系，比較急性暴露與重復暴露之間的潛在差異，評估蓄積/飽和動態，并確定是否存在性別差異。

18. 免疫原性

抗藥物抗體的評估適用于生物藥物、多肽或寡核苷酸等藥物形式，這些分子足夠大，可能引發免疫反應。

這些評估在一般毒理研究中的主要目的是確定抗藥抗體是否可能改變其暴露特征，從而改變一般毒性判定中的系統暴露標準。

在進行重復給藥毒性研究時，應測量與這些產品相關的抗體，以幫助解釋毒理研究結果。抗體反應應進行特征分析，并與藥理學和/或毒理學變化相關聯。

在解釋研究結果時，應考慮抗體形成對藥代動力學/藥效學參數、不良反應的嚴重程度、補體激活或新毒性效應出現的影響。

19. 免疫毒性

免疫毒性參數的評估采用分層方法進行。初步評估包括標準臨床病理學和病理學。如果這些評估的數據表明對免疫系統可能存在影響，則需要進一步評估。

當在標準非臨床毒性研究中觀察到免疫抑制的證據，例如骨髓抑制、全血細胞減少、白細胞減少、淋巴細胞減少或其他血液異常，或免疫系統器官重量和組織學改變（例如，胸腺、脾臟、淋巴結或骨髓等免疫系統組織的低細胞性），或腫瘤發生率增加時，可能需要額外的研究（例如免疫表型和功能檢測），以確定在暴露于受試物后，免疫系統是否受到損害。

免疫毒性要區分非預期的（不良的）免疫抑制效應和預期的（藥效學）效應。比如，抗腫瘤藥物對快速分裂細胞具有毒性，這是一個預期的終點，在這種情況下不應被視為不良反應。另一個例子是，如果藥物用于治療實體瘤，由于骨髓毒性導致的免疫抑制被認為是不良事件，但如果藥物旨在治療血液系統惡性腫瘤，則不一定被視為不良事件。

20. 血液學

以下檢測項目建議用于評估血液學變化：

血細胞比容、血紅蛋白濃度、紅細胞計數、白細胞總數及分類計數、平均紅細胞血紅蛋白量、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白濃度

凝血能力檢測（如凝血時間、凝血酶原時間、凝血酶原時間、血小板計數等）

受試化合物可能會影響造血系統，因此應采取適當措施，確保在必要時可以進行網織紅細胞計數和骨髓細胞學評估。應使用自動化網織紅細胞計數功能或空氣干燥血涂片為每只動物進行網織紅細胞計數。應為每只動物制備骨髓涂片以評估骨髓細胞學。只有在觀察到對造血系統的影響時，才需要對這些涂片進行顯微鏡檢查。

21. 臨床生化

應采集血液樣本以進行臨床化學檢測，包括電解質平衡、碳水化合物代謝以及肝腎功能的測量。具體檢測項目應包括：

肝細胞評估：至少選擇以下五項中的三項，丙氨酸氨基轉移酶（SGPT，ALT）；天門冬氨酸氨基轉移酶（SGOT，AST）；山梨醇脫氫酶；谷氨酸脫氫酶；總膽汁酸。

肝膽評估：至少選擇以下五項中的三項，堿性磷酸酶；膽紅素（總）；γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）；5'-核苷酸酶；總膽汁酸。

其他細胞變化或細胞功能的標志物：白蛋白、鈣、氯、膽固醇（總）、膽堿酯酶、肌酐、球蛋白（計算值）、葡萄糖（禁食動物）、磷、鉀、蛋白質（總）、鈉、甘油三酯（禁食）、尿素氮

然而，如果無法從試驗動物中獲得足夠的血液量，則以下檢測項目通常應優先考慮：

丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、氯、肌酐、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、葡萄糖（禁食動物）、鉀、蛋白質（總）、鈉、尿素氮

22. 尿液分析

應測定尿液量、比重、pH值、葡萄糖和蛋白質，并對尿液進行顯微鏡檢查，以評估尿沉渣和血液/紅細胞的存在。

23. 尸檢和顯微鏡檢查

大體尸檢：所有試驗動物應進行完整的肉眼檢查，包括檢查外部表面、孔口、顱腔、胸腔和腹腔、尸體及所有器官。

器官重量：應稱量腎上腺、大腦、附睪、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、睪丸、甲狀腺/甲狀旁腺、胸腺、卵巢和子宮的重量。應仔細解剖并去除脂肪和其他鄰近組織后立即稱重，以盡量減少干燥對器官重量的影響。

組織制備用于顯微鏡檢查：組織應在10%緩沖甲醛（或其他公認的固定劑）中固定，并制備切片，用蘇木精和伊紅（或其他適當染色劑）染色，以備顯微鏡檢查。肺部應在浸泡于固定劑之前用固定劑充氣。

顯微鏡評估：所有肉眼可見的病變應進行顯微鏡檢查。對照組和高劑量組的所有組織應進行組織病理學檢查。如果在某些組織中觀察到與給藥相關的效應，則應檢查這些特定組織的下一個較低劑量水平。如果在下一個較低劑量水平中仍觀察到效應，則繼續檢查下一個較低劑量水平，直到未發現效應為止。此外，所有提前死亡或在研究期間被處死的動物的組織應進行顯微鏡檢查，以評估任何潛在的毒性效應。進行組織病理學檢查的組織如下：

腎上腺、主動脈、骨（股骨）、骨髓（胸骨）、大腦（至少三個不同水平）、盲腸、結腸、子宮體和子宮頸、十二指腸、附睪、食管、眼睛、膽囊（如果存在）、哈德氏腺（如果存在）、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺（帶主支氣管）、淋巴結（一個與給藥途徑相關，一個來自遠端位置）、乳腺、鼻甲、卵巢和輸卵管、胰腺、垂體、前列腺、直腸、唾液腺、坐骨神經、精囊腺（如果存在）、骨骼肌、皮膚、脊髓（三個位置：頸椎、中胸椎、腰椎）、脾臟、胃、睪丸、胸腺（或胸腺區域）、甲狀腺/甲狀旁腺、氣管、膀胱、陰道及其它所有異常組織。

24. 供試品分析

若供試品需經溶解后（混合、混懸、溶解）給藥，應提供供試品在溶劑中的穩定性、均一性（非溶液體系）等檢測報告（濃度范圍需能覆蓋全部毒理試驗的濃度范圍），以及配制后的供試品濃度分析報告。

25. 質量保證

方案中通常需要體現質量保證部門介入的內容。

26. 統計分析

統計是判定毒理發現是否有意義的重要工具，故方案中需要明確擬進行統計學分析的指標、統計方法等。

其中，供試品分析、質量保證、統計分析部分在原文中并未包括，筆者根據情況自行添加，僅供大家參考。

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