寡核苷酸類藥物生殖毒性研究的特殊考量

寡核苷酸療法（ONT）是通過短核酸序列調控基因表達的重要藥物形式，1990年代首個反義寡核苷酸（ASO）獲FDA批準，2018年首個小干擾RNA（siRNA）獲批；截至2025年，全球獲批ONT數量大幅增加，眾多候選藥物進入臨床試驗，其在罕見病治療中優勢顯著，且逐漸用于常見疾病治療。ONT應用范圍和復雜性擴大，但其非臨床安全性評估（尤其是發育與生殖毒性（DART）評估）缺乏統一指南，制藥界在設計ONT專屬DART方案時積累了一定經驗，亟需交流分享。

由健康與環境科學研究所（HESI）DART技術委員會于2023年10月17-18日在華盛頓特區舉辦，參會者包括制藥企業、CRO及全球監管機構代表。

常規DART研究通常覆蓋一代完整生殖周期（從一代受孕到下一代受孕），分為A-F六個階段，通過不同研究評估：1）生育力與早期胚胎發育（FEED）研究：評估A-B階段（交配前至著床前）；2）胚胎-胎兒發育（EFD）研究：評估C階段（著床至硬腭閉合）；3）圍產期發育（PPND）研究：評估D-F階段（胎兒成熟、出生至斷奶、斷奶至性成熟）。如下圖所示。

EFD研究通常需在兩種種屬（嚙齒類和非嚙齒類）中開展，至少一種具有藥理反應性；生物制劑僅在兩種種屬均有藥理反應性時，才需在兩種種屬中進行研究。關于DART研究與臨床開發的時間銜接，依據ICH M3(R2)指南，EFD研究需在育齡期女性（WOCBP）入組前或根據地區要求在III期臨床試驗前完成。FEED研究需在III期臨床試驗前完成。PPND研究需在上市申請提交前完成。

ONT雖按小分子藥物監管，但具備部分大分子藥物特征，目前缺乏國際統一的ONT非臨床安全性評估指南（僅日本藥品和醫療器械局（PMDA）于2020年發布相關指南）。現有ONT DART評估方法采用混合策略，同時應用小分子藥物（如ICH M3）和生物制劑（如ICH S6）的評估原則；ICH S5(R3)指南雖涵蓋小分子和生物制劑的DART評估考量，但ONT獨特屬性使其在應用該指南原則時仍存在諸多疑問。2024年11月，ICH管理委員會批準一份概念文件，計劃制定新ICH安全指南《寡核苷酸療法非臨床安全性評估》，DART評估建議將是其中需協調的內容。2024年11月，FDA發布ONT非臨床安全性評估指南草案，其中包含DART評估要求，其基本原則與本次研討會成果一致。

本文就HESI會議中的相關觀點進行總結。

ONT的獨特產品屬性

ONT具有獨特產品屬性，下圖對比了小分子、ONT和生物藥的區別。

應用DART原則時需逐案考量，核心屬性包括以下5點：

化學合成與修飾：ONT為化學合成產物，含與內源性核酸不同的化學修飾，可能引發與化學/物理結構相關的毒性。

靶向性與種屬特異性：其靶向性和種屬特異性介于小分子藥物與生物制劑之間，雖設計為與特定核苷酸序列結合（可能具有種屬特異性），但也存在與非預期靶點結合的潛在可能。

細胞分布與藥效動力學：能快速進入靶細胞并在其中滯留，長時間發揮藥效動力學（PD）作用，形成獨特的動力學和藥理學特性，設計DART研究給藥方案時需納入考量。

遞送偶聯成分：常含遞送偶聯成分（如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、轉鐵蛋白受體抗體），可促進靶組織細胞對ONT的攝取，同時減少向其他組織的分布。

平臺復用性與證據權重法：相同的“平臺”（含偶聯成分、連接子、化學修飾）可用于多種ONT，引發“能否將一種ONT的研究數據復用至同平臺其他ONT”的疑問；雖可采用證據權重（WoE）法評估ONT的DART風險，但可能需結合實驗或計算數據，以全面考量其對人類的潛在風險。

ONT的DART研究毒性類型

ONT的DART研究中，毒性潛在來源可分為靶向毒性、脫靶毒性、化學/物理屬性相關毒性三類，具體差異如下：

也可參考下圖，更形象一些。

評估ONT毒性時，需先明確毒性機制：1）對于依賴雜交的毒性（靶向/脫靶），可通過人類數據庫的計算機模擬分析、人類樣本體外實驗、基因生物學特征研究等方式預測；2）對于不依賴雜交的脫靶毒性，需考量化合物結構、化學/物理屬性（含制劑影響）及受體/蛋白相互作用。

發育毒性研究中的特殊考量

母鼠給藥ONT后，可能對胎盤、發育中胚胎/胎兒這兩個普通毒性研究未涉及的部位產生靶向或脫靶毒性，需關注以下3點：1）毒性產生途徑：毒性可能源于ONT在這些部位的分布，也可能是ONT改變母體生理狀態（與胎盤或胚胎/胎兒無直接關聯）間接導致；2）種屬差異影響：不同種屬的發育生物學特征差異會影響毒性評估結果的轉化，例如：人類胎盤是唯一的營養轉運器官，也是外源物質進入胚胎的潛在通道；而大鼠和兔的早期妊娠中，內臟卵黃囊承擔該功能，后期才由胎盤接管。大鼠早期器官發生階段，內臟卵黃囊完全包裹胚胎；兔的內臟卵黃囊則保持開放，胚胎可能直接接觸母體分泌物，增加外源物質進入胚胎的途徑。采用小型豬等替代動物模型時，還需考量胎盤類型和特征的差異；3）胚胎暴露的種屬差異：早期發育階段的種屬差異還會影響胚胎藥物暴露的調控，如母體與胚胎/胎兒間的pH梯度、胎盤轉運體和代謝酶、胚胎與母體體液中的蛋白結合差異等。

雖可通過研究妊娠動物器官發生期的ONT暴露動力學，為動物研究結果提供背景，但動物妊娠期任一階段胎兒體內ONT的有無，均無法直接預測其能否進入人類胚胎/胎兒。

受試種屬的藥理學相關性考量

常規種屬的局限性：ICH S5(R3)將大鼠、兔定義為DART研究的“常規受試種屬”，因其特性明確、能有效檢測治療相關效應，但ONT具有序列依賴性和種屬特異性，常規種屬可能無法滿足靶向評估需求，人類和非人靈長類動物（NHP）常是唯一具有藥理學相關性的種屬。

替代ONT的應用：若條件允許，可設計與常規DART種屬目標基因類似物結合的替代ONT，以全面評估ONT的藥理學相關風險。帕替瑞南（ONPATTRO?）、奈多司蘭（RIVFLOZATM）等獲批GalNAc-siRNA已采用該方法，替代分子的特性分析和研究設計將在下文進一步說明。

替代ONT的局限性：因傳統DART種屬的基因/蛋白表達差異或目標基因缺失，替代ONT方法可能不適用；若替代ONT需結合種屬特異性遞送成分（如抗體），會進一步增加復雜性，相關內容將在下文詳述。

NHP的應用限制：NHP因藥理學相關性，常被用于ONT的普通毒性評估，但NHP的DART評估在設計和范圍上靈活性低、穩健性差（每只母猴僅1個后代，評估數量有限），僅在無法預先排除靶向/脫靶風險，且常規種屬、替代模型經全面評估被證明不適用時，才可考慮使用NHP。

ONT的PK/PD脫節問題

ONT的PK/PD特性特殊，需針對性調整DART研究方案，核心考量包括3點：

給藥頻率差異：ONT從體循環清除快，但組織滯留時間長，藥效持續久，臨床常采用低頻給藥（每周、每月、每季度甚至每年1次），一般毒理研究也會模仿該模式采用間歇給藥；但DART評估（尤其是EFD研究）需在關鍵發育階段維持持續的全身暴露和藥理活性，妊娠期低頻間歇給藥并非最佳選擇，需增加給藥頻率，以維持兩次給藥間的血漿暴露量，后續會詳述。

給藥起始時間調整：需結合目標蛋白調控的起始時間、給藥時間、目標RNA降解時間，調整給藥起始點，確保DART研究中目標暴露期內，能實現預期的蛋白調控藥理效果。

給藥途徑選擇：ONT的臨床給藥途徑（如鞘內注射）可能難以在非臨床DART種屬中復制，需選擇最適合的DART研究給藥途徑，以模擬相關臨床暴露。

證據權重法與平臺法的應用

證據權重法（WoE）：若有充足信息說明ONT靶向藥理學相關風險，可依據ICH S5(R3)、ICH S6(R1)及相關文獻，在ONT的DART策略中應用WoE法。

平臺法：平臺法是ONT特有的概念，理論上可用于支持EFD評估僅用單一種屬，或豁免全面的脫靶DART潛在風險評估，但研討會召開時，該方法尚未應用于獲批ONT。其核心邏輯為：若同平臺（相同偶聯成分、連接子、化學修飾）的另一種ONT已通過EFD研究證明無不良效應，且與未測試候選藥物僅核苷酸序列不同，則針對不依賴雜交的脫靶毒性風險的“平臺法”，可補充依賴雜交的DART（靶向/脫靶）風險評估，為整體DART風險提供充足信息；若某平臺出現DART信號，該數據也可納入WoE，可能無需額外開展DART研究。不過，這種偏離小分子藥物EFD策略的方法，目前大概率不適用于多數ONT；若需大幅偏離ICH要求，建議與監管機構溝通并獲得批準。

下文詳細介紹下會議細節：

監管機構視角

日本藥品和醫療器械局（PMDA）

PMDA全面回顧了日本針對ONT評估的指南，重點聚焦DART評估中的潛在毒性。該指南將ONT誘導的毒性分為雜交依賴性和雜交非依賴性兩類。

在靶向毒性評估方面，PMDA強調使用具有藥理學相關性的動物模型的重要性，且更傾向于使用替代ONT而非NHP。

針對雜交依賴性脫靶毒性，主張采用定制化評估方法，如計算機模擬分析和人類細胞的RNA測序（RNAseq）。同時強調需開展全面的體外基因表達分析（尤其針對siRNA的安全性評估），且要確保計算機模擬算法和數據庫的可靠性。

在評估雜交依賴性靶向與脫靶毒性時，若ONT的胎盤轉運顯示胎兒暴露量低于生物學顯著水平，該數據可作為WoE評估的一部分。

最后，PMDA探討了ONT化學修飾引發的雜交非依賴性脫靶毒性，指出EFD研究中給藥頻率設定的挑戰，以及采用平臺法減少臨床候選藥物毒性研究的可行性問題。PMDA代表特別強調，鑒于有研究報道ASO在非臨床研究中存在序列依賴性急性毒性，而平臺法無法排除此類毒性，因此對采用平臺法評估毒性持謹慎態度。

荷蘭藥品評估委員會（MEB）

MEB指出，歐盟目前尚未就ONT形成統一立場。MEB希望進一步探索如何利用同類產品的數據，免除新產品開展傳統DART研究的需求（即證據權重法）。例如，若產品具有相同的化學結構/骨架修飾且靶向同一基因，但序列不同，可考慮通過非DART體外或體內橋接研究，判斷序列變化是否會引發新的毒性；若已有ONT非偶聯形式的DART數據，可利用該數據評估相同序列GalNAc偶聯形式的DART風險。

美國食品藥品監督管理局（FDA）

在DART安全性評估方面，FDA強調ONT屬于ICH S5(R3)的適用范圍，但同時也指出ONT的特定屬性（尤其是體循環清除快、組織滯留時間長，進而導致PD持續時間長）給DART研究（尤其EFD研究）設計帶來獨特挑戰。

關于EFD研究建議，FDA的立場與PMDA基本一致：通常要求在兩種物種中開展EFD評估，且至少在一種物種中評估預期藥理活性。若NHP是唯一對臨床候選藥物有反應的物種，FDA同樣更傾向于在嚙齒類研究中使用替代分子開展試驗，而非直接使用NHP。

FDA要求使用兩種物種開展研究的依據是：堿基序列對雜交非依賴性脫靶毒性有顯著且不可預測的影響，且不同化學結構也可能產生獨特的毒性效應。

案例研究與討論

11位來自活躍開發ONT的大小型生物技術或制藥企業的代表進行了案例分享。這些案例圍繞生殖周期不同階段的劑量設定與給藥頻率、種屬選擇等展開。

（一）劑量水平選擇

確定合理的高劑量是科學嚴謹的DART評估的核心。根據ICH S5(R3)，DART的劑量合理性需基于所有可用信息，包括藥理學、PK和重復給藥毒性數據。

對于ONT，除需遵循ICH S5(R3)中關于靶向藥理相關PD的通用考量外，脫靶效應風險與器官內蓄積往往直接影響劑量選擇。低劑量水平的設定遵循標準實踐：通過評估劑量反應確定未觀察到不良效應水平（NOAEL），并參考預期或計劃的臨床劑量。

由于ONT獨特的動力學與PD特性，劑量設定需考慮靶組織濃度。這一步可能需要額外研究或檢測終點，例如在兔中開展暴露評估——兔通常不用于一般毒性研究。高劑量與劑量范圍的選擇需結合ONT的特殊考量，同時遵循成熟的DART與一般毒理研究實踐。

1.常見劑量選擇依據及優劣

毒性終點法或暴露邊際法是最常用的劑量選擇依據，下表列出了各種劑量選擇方法及簡要優劣對比。ONT的DART評估中，多采用基于最大耐受劑量（MTD）、血漿暴露或劑量邊際的劑量選擇方法。

（二）給藥方案

ONT的劑量水平與給藥方案選擇往往相互關聯。研討會強調，DART研究的劑量與給藥方案需綜合考量計劃臨床給藥方案、ONT的化學/物理特性、PD、PK和毒性特征，以確保關鍵DART時期的適當全身暴露，為人類風險評估提供充分依據，如下表所示。

1.不同DART研究階段的給藥方案共識

EFD研究：盡管臨床低頻給藥，但研討會共識認為，EFD研究中需在整個器官發生期維持PD效應與足夠全身暴露，以覆蓋化合物所有潛在敏感期。這一原則適用于所有藥物類型，但對ONT而言，需平衡“高頻給藥維持穩定暴露”與“避免組織蓄積、過度PD效應或組織負荷相關毒性（與臨床給藥模式無關）”。

FEED研究與PPND后期（非妊娠期）：共識認為，采用與一般毒理研究一致的間歇給藥即可滿足安全性評估需求，前提是給藥間隔不超過臨床預期頻率。

2.平衡暴露與蓄積的給藥方案設計

有多種給藥方案可在“保障發育敏感期暴露”與“減少組織蓄積、過度PD效應或超出耐受性”之間實現平衡（如上表）：

分次給藥：將一般毒理研究中的每周或每月劑量，拆分為每日或每周多次的小劑量。高劑量與方案設計通常以“避免親本毒性”為目標，同時確保經非臨床與臨床給藥方案調整后，基于血漿AUC的暴露邊際達到足夠水平（如25倍于MRHD）。但該方法的劣勢是，母鼠每日血漿Cmax可能低于臨床水平，進而降低胚胎/胎兒的相關暴露。

組織濃度基準法：通過對比“嚙齒類分次給藥后靶組織（如肝臟）濃度”與“普通毒性研究中同劑量但低頻給藥的組織濃度”，驗證親本暴露是否充分，兩者應達到等效水平。

3.分次給藥案例：ASO英利昔蘭（TEGSEDI?）

英利昔蘭的臨床獲批劑量為每周284mg（約4mg/kg/周）。在小鼠聯合FEED/EFD研究中，英利昔蘭的每周劑量為10.5、52.5、87.5mg/kg/周，小鼠活性替代ASO劑量為52.5mg/kg/周：

雄鼠在整個研究期間（約10周）均采用每周給藥。

雌鼠交配前每周給藥，器官發生期調整為隔天給藥（每周3.5次），劑量為3、15、25mg/kg/次。

兔EFD研究同樣采用每周3.5次給藥，劑量為2.5、5、15mg/kg/次（對應每周8.75、17.5、52.5mg/kg）。

考慮到英利昔蘭在嚙齒類和非嚙齒類中的組織半衰期分別約為2周和4周，隔天給藥被認為可平衡“評估所需的足夠暴露倍數”與“避免過度組織蓄積及潛在干擾毒性”。

4.其他給藥方案考量

特殊場景調整：需結合種屬PD相關性、是否需使用替代ONT、普通毒性研究提示的頻繁給藥耐受性、或臨床給藥途徑的技術挑戰設計方案。若無法耐受高頻給藥，可采用多組動物錯開給藥時間的方式覆蓋不同妊娠日，但該方法因需大量孕鼠而較少使用。

給藥起始時間：需結合生殖周期階段確定。若需在DART研究常規給藥起始日前提前給藥，以在評估生殖/發育關鍵節點前降低或調控目標RNA/蛋白水平，需參考以下信息：給藥后目標RNA（可能包括蛋白）的變化水平與持續時間；變化是否具有藥理相關性（如10%的降低可能無意義，需在發情周期評估、交配或器官發生前追加給藥）；蛋白半衰期（用于判斷僅評估RNA是否足夠，還是需同時評估蛋白——短半衰期蛋白的RNA與蛋白水平會同步變化，長半衰期蛋白的RNA水平快速下降后，蛋白水平下降存在滯后，僅評估RNA無法準確反映功能蛋白量）。這些因素將決定給藥提前時間與方案，以平衡預期效應與避免過度蓄積。

聯合DART研究：可通過聯合研究實現合理給藥起始時間。例如，若需2周時間調控目標蛋白，開展雌鼠聯合FEED/EFD研究（A-D階段）比單獨研究更具策略性，可在交配與妊娠前達到充分藥理效應。根據實現目標PD所需時間，也可在動物著床前首次給藥，但需注意：若臨床或替代ONT導致著床前丟失，窩仔數減少或全窩丟失會影響FEED研究向EFD研究的延伸，需單獨開展EFD研究。因此，在啟動聯合FEED/EFD研究前，可通過“給藥起始于著床前的劑量探索性EFD研究”評估該風險。

5.替代ONT的給藥頻率與時機

替代ONT的給藥頻率與時機需根據預期藥理調整：若替代分子的PD活性持久，需基于母鼠靶組織中PD的持續時間確定給藥頻率，核心是“維持臨床相關PD效應”并“避免與臨床無關的替代ONT脫靶效應”。

盡管多數參會者認可此方法，部分案例也采用了該給藥頻率，但需注意：以“在母鼠中引發PD效應”為目標設定的給藥頻率，無法完全覆蓋“胚胎或胎兒中直接發生PD效應”的可能性，還需參考胚胎發生過程中目標基因的發育表達信息。

（三）毒代動力學考量

ONT的體循環半衰期較短，通常僅數小時，但在靶組織中的半衰期顯著更長，導致其藥理效應可維持數周至數月。因此，ONT給藥可能出現特殊情況：特定時間點存在PD效應，但無全身（如血漿）暴露。

1.ONT暴露評估的常規方法與調整

常規暴露評估：多數企業或申辦方通過在DART研究的首次和末次給藥日進行毒代動力學評估，或在達到假定暴露穩態后評估全身暴露。

方法調整：可通過增加額外采樣時間點，確認關鍵節點（如交配、著床、器官發生期）的全身暴露，該原則同樣適用于ONT。但需注意，確認ONT本身的全身暴露可能并非最重要的考量點。

更全面的暴露評估：PD評估（mRNA和/或蛋白水平）與相關組織的生物分析，能更全面地反映ONT暴露情況。

2.ONT的胎兒暴露與討論

少量獲批ONT通過檢測胎盤、胎兒血漿、肝臟、腎臟等組織的濃度并評估PD，探究ASO和siRNA是否能到達胎兒部位。

從有限數據來看，胎盤內可檢測到ASO和siRNA；胎兒肝臟中的ASO通常無法定量，而siRNA可能在胎兒組織和血漿中低水平存在。上市ONT奈多司蘭（RIVFLOZA?）在兔羊水樣本中被檢出，但這是唯一的羊水相關數據。

3.ONT的其他暴露途徑（精液、乳汁）

精液暴露：小分子藥物向精液的轉移率低，低分子量藥物通過精液轉移給女性伴侶，導致女性伴侶血藥濃度比男性低至少三個數量級。ONT分子量通常大于小分子、小于生物制劑，其經陰道上皮吸收進入全身循環的特征尚未明確，但預計吸收有限。即使ONT進入循環，其體循環半衰期也較短（僅數小時）。總體而言，ONT通過精液轉移給男性患者的女性伴侶，并達到具有生物學意義的全身濃度的可能性，與小分子藥物相當或更低。

乳汁暴露：ASO和部分siRNA在乳汁中可被定量，但通常水平較低。由于ONT口服生物利用度低，哺乳期暴露給母乳喂養嬰兒的全身暴露量可能可忽略不計。上市siRNA魯瑪司蘭（OXLUMO?）和伏妥司蘭（AMVUTTRA?）在幼崽體內未被檢出；某GalNAc偶聯siRNA的PPND研究案例顯示，出生后第4天（PND4）幼崽體內可檢測到暴露，PND11時暴露量下降，表明乳汁轉移水平低或無轉移。需注意，ONT制劑可能通過修飾提高口服生物利用度，若進行此類修飾，需考量其對哺乳期暴露風險的潛在影響。

4.GalNAc偶聯ONT的PD評估

對于GalNAc偶聯ONT或其他遞送形式，需在母體靶組織（如肝臟、腎臟）評估ONT遞送相關的PD，也可考慮在相應胎兒組織中評估PD；若目標基因在其他母體組織中表達，這些組織也可能需要分析。由于胚胎-胎兒發育過程中基因表達水平和模式可能存在差異，需確定胎兒組織的評估時間點，同時考慮組織發育時間與足月前收集組織的技術難度。

（四）種屬選擇

1.常規DART種屬的選擇與ONT特殊性

常規種屬優勢：根據ICH S5(R3)，大鼠或小鼠是DART評估最常用的嚙齒類種屬，兔是EFD評估最常用的非嚙齒類種屬，因其有豐富的歷史對照數據、妊娠周期短且穩定、窩仔數多、動物易獲取。

ONT的特殊性：ONT可能在大鼠或兔中無活性，但這些常規DART種屬仍可用于全面評估ONT的脫靶DART潛力。例如，近期獲批的GalNAc偶聯siRNA奈多司蘭（RIVFLOZA）的DART數據顯示，兔EFD研究中觀察到骨骼和心血管系統畸形，而嚙齒類模型中未檢出；給藥首日母兔體重下降，但隨后恢復至與對照組相當的體重。該畸形的發生機制尚不明確，但兔并非藥理學相關種屬，由此證明ONT的脫靶毒性在嚙齒類和兔中可能存在差異。

2.靶向（依賴雜交）DART評估的種屬選擇

藥理學相關種屬需求：靶向DART評估需使用藥理學相關種屬。ONT通常能在NHP中誘導預期藥理反應，但NHP的DART評估因倫理、科學等原因存在挑戰，并非理想選擇。

替代ONT的應用：可制備與人類目標序列類似、化學結構與臨床ONT完全一致的替代ONT，用于常規DART種屬（通常為大鼠或小鼠）。通過在DART研究中設置單獨組別，同時評估臨床候選藥物與替代分子，可將替代方法與臨床候選藥物的脫靶毒性（不依賴雜交的化學誘導毒性、依賴雜交的脫靶序列雜交毒性）評估相結合。如下圖所示。

替代ONT的研究設計：在同一EFD研究中同時使用嚙齒類替代ONT與臨床候選藥物，可在單一種屬中完成全面評估，第二種屬僅用于評估脫靶潛力。該嚙齒類替代方法也可應用于FEED、PPND研究。雖加入替代分子組會增加動物用量（相比標準小分子DART評估），但可避免使用NHP；且如ICH S5(R3)所述，評估臨床候選藥物脫靶效應時，有時少于三個劑量水平即可滿足風險評估需求。

3.替代ONT的特性考量

替代ONT的選擇標準：需在受試種屬中具有藥理活性、目標基因敲降幅度等于或大于臨床候選ONT在人類中的預期幅度、序列長度與化學修飾與臨床候選藥物相似。

替代ONT的定位：替代ONT不能替代臨床候選藥物的評估，兩者均需在DART研究中評估。

替代ONT的生產與特性：多數使用替代方法的案例表明，“研究級（research grade）”材料（non-GMP條件）已足夠，因其主要用途是證明目標PD效應并評估與PD相關的潛在DART風險。替代材料不用于臨床，也不適用于設定人類風險評估的安全邊際。

共識觀點：研討會共識認為，替代方法是評估目標敲降相關毒性的首選工具，優于NHP。替代方法與NHP DART方法均可用于風險識別，但替代模型的優勢在于可在常規種屬（通常為嚙齒類）中開展更穩健的DART評估。該建議與ICH S6(R1)中生物制劑“優先在NHP中使用臨床候選藥物而非嚙齒類活性替代分子”的表述不同，但日本PMDA指南與美國FDA指南草案均認可該方法在適用場景中的可行性。

4.轉基因或疾病狀態動物模型的特性考量

評估靶向毒性的替代模型還包括轉基因動物模型，或在正常健康動物模型中誘導疾病狀態藥理反應。開展DART研究前，需對這些替代模型進行特性鑒定，確保品系的生殖和發育特性適合且穩定，可用于DART測試。建議與監管機構溝通，確保模型使用的科學依據符合要求。

5.生物偶聯ONT的種屬選擇考量

生物偶聯ONT的發展：為提高ONT的代謝穩定性、藥代動力學性能和效力，研究人員已實現ONT向肝臟外靶組織的高效遞送，例如通過將ONT與單克隆抗體、抗原結合片段、細胞穿透肽、脂質等配體偶聯，實現向骨骼肌、心臟、中樞神經系統等肝外組織的遞送。因此，處于研發階段的偶聯ONT類型不斷增加，以將RNA靶向療法應用于更廣泛的組織和疾病。

額外考量要點：與非偶聯ONT（如連接子-ONT、游離ASO）或化學合成偶聯物（如GalNAc）相比，蛋白偶聯ONT療法的DART評估需更多考量：需基于偶聯ONT所有組分的藥理和非特異性特性，全面理解其安全性；若生物部分（如單克隆抗體、抗原結合片段）與ONT偶聯，除ONT本身外，還需考量生物遞送組分的過度藥理效應；偶聯ONT與臨床前種屬的交叉反應性，是制定安全性評估策略的重要因素。

種屬選擇策略：生殖風險評估可使用與臨床候選ONT化學修飾和藥理特性相當的嚙齒類活性替代ONT；對于僅結合人類受體的偶聯ONT，可考慮使用敲入人類轉運受體的轉基因小鼠模型，在替代小鼠模型中評估臨床候選藥物；若NHP是唯一的藥理學相關種屬，可考慮使用替代種屬（如嚙齒類），在該種屬中使用經適當驗證的嚙齒類活性替代ONT，并偶聯具有適當交叉反應性的遞送組分。

復雜偶聯ONT的評估方法：若復雜ONT偶聯物可選擇非NHP DART評估方法，在常規DART種屬（如嚙齒類）中分別測試各藥理組分（遞送蛋白偶聯物、ONT）的生殖毒性，可能是最謹慎可行的方法，但需注意各組分的潛在疊加效應，以及與臨床候選藥物在組織分布上的差異；也可測試嚙齒類替代蛋白-ONT偶聯物或“雙重替代物”（含嚙齒類活性的蛋白和ONT）；若某類效應已明確，或有足夠數據說明遞送偶聯物受體結合與目標敲降的生殖風險，可考慮采用WoE綜合評估，替代蛋白偶聯ONT的動物研究。與所有藥物類型和ONT一樣，使用替代方法需提供科學依據，需考量潛在風險并與衛生監管機構溝通達成共識。

6.非常規DART種屬（NHP、小型豬）

非常規種屬的適用場景：部分項目可能無法使用常規DART種屬（嚙齒類、兔）；若傳統DART種屬與人類在目標RNA表達上存在差異或目標RNA缺失，替代ONT也可能不適用。

研討會中無使用非常規種屬開展DART研究的案例，但有兩個報告介紹了使用非常規種屬開展幼年動物研究，以支持兒科適應癥。

（五）ONT脫靶DART評估的額外可用數據

ONT研發過程中產生的計算機模擬、體外、體內數據，均可能用于DART評估，這些信息對判斷是否可采用WoE或平臺法評估特定ONT的DART風險至關重要，以下簡要總結相關技術，包括識別依賴雜交和不依賴雜交的潛在毒性機制的方法。

1.依賴雜交的脫靶效應評估

計算機模擬評估：在ONT設計與優化階段，通過計算機模擬評估依賴雜交的潛在作用，選擇ONT序列時盡量減少對人類基因組的非預期作用。若識別出可能與ONT雜交的基因，需進一步研究ONT改變這些基因表達的可能性，包括雜交錯配數量、在脫靶基因中的雜交位置、基因表達組織，同時需關注脫靶基因功能（尤其EFD研究，因基因在發育中胚胎和胎盤中的功能，可能與在成年器官中不同）。

實驗性表達譜分析：選定候選ONT后，可通過實驗性表達譜分析，研究依賴脫靶雜交的潛在下調效應。通常將ONT轉染至細胞系或原代細胞的2D培養體系，通過定量PCR分析潛在脫靶基因的表達變化。若在相關濃度下觀察到顯著的基因表達變化（如達到相當靶向效力的10倍），需進一步研究這些基因，必要時采用體內技術；若計算機模擬評估顯示非預期靶點可能僅在生殖組織、胎盤或胚胎/胎兒組織中表達，需使用能捕捉該表達的適當細胞類型。

2.不依賴雜交的脫靶效應評估

體外評估不依賴雜交的脫靶效應，可通過RNA測序或類似方法，無偏倚地分析細胞中的基因表達變化。這類方法無需了解特定基因序列，可檢測不依賴作用機制的基因表達變化；可將人類細胞系或原代細胞轉染或用目標ONT處理，識別基因表達變化。但需注意，這類方法較新，需大量工作優化細胞系統、確定后續步驟、理解體外結果向潛在體內效應的轉化。

3.替代模型在DART評估中的應用

如ICH S5(R3)所述，體外和離體方法已被用作動物研究的替代方法，預測對胚胎-胎兒發育的潛在影響，例如斑馬魚、大鼠或兔全胚胎培養、體外模型（如胚胎干細胞）。這些方法也可能檢測依賴和不依賴雜交的脫靶效應，監管機構可能接受其作為DART評估的一部分，但需對其進行嚴格驗證以作為DART篩選工具（這一過程可能較為復雜）。此外，這些模型多為評估小分子藥物或化學品開發，其在ONT評估中的適用性尚不清楚。

總結

1.設計DART策略與研究時，當前采用哪些方法應對ONTs的獨特屬性？

與小分子藥物評估的監管要求一致，多數案例研究在標準DART試驗中使用常規動物種屬，即EFD研究用嚙齒類和兔， FEED及PPND研究用嚙齒類，旨在捕捉潛在的靶向與脫靶DART效應。

對于處于研發或已獲批的ONTs（含ASO、siRNA），其劑量設定與給藥頻率策略結合了小分子與大分子方法，具體取決于產品屬性。

盡管給藥方案不同，但多數策略會通過特定給藥頻率維持全身暴露，以在胚胎快速發育期評估脫靶毒性或維持PD反應。整體方法因所用模型類型、特定ONT或偶聯成分屬性、是否采用WoE法而存在差異。

不同案例研究與申辦方在劑量設定、生殖周期非妊娠階段給藥頻率、替代分子或替代模型研究設計、種屬/模型選擇及暴露或PD檢測方面的方法，均因產品屬性不同而有所區別。

2.非傳統小分子DART策略的替代方法，在實施與認可方面是否有進展？

研討會核心討論點之一：對于一系列化學結構相同的ONTs，能否采用“平臺法”預測其DART終點效應，而非對每個ONT開展完整DART研究。具體而言，若某一ONT已完成全面DART研究，且另一化學結構相同的ONT無特定藥理活性相關擔憂，前者研究中確認的危害或無危害結論能否推廣至后者。

“平臺法”在研討會及現有公開信息中均無該方法的應用案例。不同地區監管機構對“平臺法”的態度未完全統一，擔憂即使ONT序列存在微小差異，也可能導致靶向效應及脫靶毒性（雜交依賴性與非依賴性）的差異。

各地區監管機構一致認為應用該方法需滿足重要前提：首先明確“平臺”的定義，涵蓋偶聯結構、化學連接子及化學修飾，僅當ONT在這些方面完全一致時才可考慮“平臺法”；其次，需為平臺內新ONT收集額外信息，包括通過可靠的計算機模擬（in silico）、體外甚至體內試驗，全面評估脫靶雜交依賴性或序列相關毒性風險。

新一代ONTs研發速度快，若相關ONT的化學/物理性質存在差異，可能難以找到足夠相似的已完成DART評估的平臺進行數據外推。

已明確多個需進一步開發的領域，或可改變嚴格采用小分子雙種屬EFD方法的需求，例如若體外或離體新方法經驗證可用于ONTs，則可納入應用。對于種屬特異性強的ONT偶聯物，需開發針對其兩部分成分毒性的評估策略。在制定DART評估新策略（含“平臺法”）時，需盡早與監管機構頻繁溝通，確保方案可被接受。

3.是否可明確種屬/模型選擇、動物模型替代方案（用于捕捉寡核苷酸靶向與脫靶毒性潛力）、給藥方案、替代分子或轉基因動物模型研究設計等方面的最佳實踐？

參會者就以下適配多數ONTs屬性的研究設計方法達成共識：

妊娠期給藥頻率：臨床候選藥物脫靶評估需采用每日或隔日給藥等方案，維持妊娠期全身暴露穩定；臨床候選藥物或替代分子的靶向評估，需采用能在妊娠期維持與臨床預期相似程度的穩定靶基因敲低的給藥方案。

生殖周期非妊娠階段給藥頻率：生殖周期非妊娠階段（交配前、交配期、哺乳期）無需持續維持全身暴露，否則可能引發與組織蓄積相關的毒性，且不符合臨床給藥場景（每月至每年一次給藥即可實現長效靶標調節）；FEED或PPND研究非妊娠階段采用每周給藥，更接近臨床給藥頻率，且能充分覆蓋生殖周期關鍵階段。

劑量設定：ICH S5(R3)中描述的標準高劑量選擇原則可適用，但需考慮臨床與非臨床研究在給藥頻率及靶基因敲低程度上的差異；EFD研究中應對高劑量與不同給藥頻率的常用方法是“分次給藥”，例如將一般毒性研究中的周劑量按1/7或1/3拆分，分別每日或隔日給藥，以在維持相同周劑量的同時，保證妊娠期暴露穩定。

種屬選擇：常規DART種屬（嚙齒類、兔）適用于ONTs DART研究，且至少需有一種種屬能體現藥理活性；即使無PD效應，使用這些種屬仍具有合理性，可全面評估脫靶雜交依賴性與非依賴性效應；優先使用替代分子檢測PD效應，而非采用NHPs進行DART研究。

替代分子研究設計：替代ONT可用于評估靶基因敲低相關的DART潛在危害，但不能替代臨床候選藥物的脫靶評估，也無法提供風險評估所需的劑量或暴露邊際信息；替代分子的所有研究設計需以靶標調節為核心，其劑量選擇、給藥頻率與時間需盡量降低替代分子脫靶效應的可能性（此類效應與臨床給藥無關）。

體內替代模型研究設計：疾病狀態模型等常規DART模型的替代模型，需充分表征其背景DART異常情況，并確保給予臨床候選藥物后能產生預期藥理作用。

暴露與PD評估：關于胎盤、胎兒腔室及乳汁中ONT暴露潛力的數據有限，生成ONT或ONT類別相關的胎盤/胎兒暴露或基因調節數據，可能為研究設計提供支持或作為WoE法的組成部分，但需考慮種屬間胎盤轉運動力學差異及該數據對人類風險識別的整體價值；即使ONT不蓄積于胎盤或不進入胎兒腔室，仍可能對胚胎-胎兒發育產生影響，因此胎兒無暴露不能排除開展EFD或PPND研究的必要性。

4.隨著ONTs成分復雜性提升（含使用多種不同遞送偶聯物），該藥物類別發展過程中出現了哪些額外考量點？

隨著偶聯成分范圍擴大、化學修飾增多（以靶向新組織腔室并擴大適應癥范圍），ONTs DART測試策略的復雜性不可避免。

如抗體偶聯siRNA案例所示，DART模型的種屬相關性及對特定藥代動力學屬性的理解，將影響多數策略決策；但隨著ONT產品屬性演變，仍需依據ICHS6(R1)及相關資料（Cavagnaro.,2014）中描述的“個案處理”原則。

5.全球監管機構對ONTs的DART評估是否達成共識？

來自7個全球衛生機構的監管人員參與研討會或發表演講，表明行業與監管機構在“為ONTs制定恰當且具有科學依據的DART策略”這一共同目標上的合作日益加強。

監管機構代表一致認為ONTs需開展DART評估，且評估總體應遵循ICH S5(R3)中規定的小分子藥物原則；但因實踐方法可能隨產品屬性不同而變化，需就具體評估方案與監管機構進行個案溝通。

各方對“平臺法”的看法存在一定分歧，但均認同需建立特征明確的平臺，并為平臺內ONTs生成充足數據以支持該方法應用。據悉，正在起草的ICH指南將就此達成共識。

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