關于寡核苷酸類藥物開展組織分布研究的些許工業界經驗

寡核苷酸治療藥物（Oligonucleotide therapeutics, ONTs）已成為一類具有變革意義的新型藥物，主要包括siRNA、ASO、mRNA、適配體以及單鏈和雙鏈DNA寡核苷酸等。過去十年中，得益于其良好的安全性以及能夠靶向以往“不可成藥”的通路，這類藥物在制藥研發管線中的地位日益突出。

寡核苷酸具有模塊化設計特點，使其在早期研發階段能夠快速迭代優化，尤其適用于探索全新作用機制的項目。同時，化學修飾技術與靶向遞送系統的顯著進步——如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯物和脂質納米顆粒（LNP）等——大幅提升了組織特異性和治療指數，從而提高了臨床成功率。

與傳統小分子藥物不同，ONTs展現出獨特的藥代動力學特征：系統清除迅速，但在靶組織中滯留時間較長，導致其PK-PD關系更為復雜。這種特性使得暴露-效應評估變得困難，因為血漿中的系統濃度往往無法準確反映靶組織的實際藥物暴露水平。因此，對治療活性和安全性的評估越來越依賴于組織特異性藥物濃度，凸顯了建立可靠生物分析策略以表征藥物體內分布的重要性。

盡管業界已普遍認識到組織藥物濃度測定的重要性，但各公司在具體實施方法上仍存在較大差異。美國FDA近期發布的《寡核苷酸治療藥物臨床藥理學考量》草案指南明確強調，需開展全面的體內分布研究，并采用穩健的生物分析方法來定量寡核苷酸母藥及其相關代謝物。這一監管導向進一步凸顯了行業亟需就組織水平評估的最佳實踐達成共識。

本文分享下IQ Consortium調研的11家制藥企業在ONT體內分布評估方面的實際操作情況。

體內分布評估的頻率

在10家明確開展ONT研發的公司中：50%始終在發現和開發階段評估體內分布；40%根據具體項目需求或以探索性方式開展；10%則根據化合物特性靈活決定，而非例行進行。

此外，70%的公司在候選藥物確認過程中常規測定組織藥物濃度，30%則間歇性開展。

企業開展常規體內分布評估的主要動因

確認藥物在作用部位的暴露；支持PK/PD建模；評估藥物在靶器官和清除器官中的分布；為基于PBPK和TK模型提供數據支持。

組織藥物濃度測定策略與時間節點

30%的公司將組織濃度分析視為選擇性手段，而非常規操作。這類評估通常依據以下關鍵因素觸發：需確認藥物在藥理相關組織中的分布；監測已知或潛在毒性部位的暴露；應對體內研究中出現的意外結果。

在這些情況下，組織水平的PK數據成為連接給藥劑量、分布特征與藥效/安全性結果的關鍵機制橋梁。

評估時間點分布如下：1）先導化合物（lead compoud）優化前：50%的公司進行組織濃度測定，主要用于早期藥理篩選；2）先導優化至候選藥物(PCC)選定階段：比例升至90%，反映此階段對理想組織分布特性的高度依賴；3）候選藥物確定至首次人體試驗（FIH）前：80%的公司持續開展組織測定；4）FIH之后：比例回落至50%，表明此時更多依賴前期建立的PK模型和安全性數據。

臨床前動物種屬與組織采樣情況

在臨床前研究中，小鼠（包括C57BL/6、CD-1和BALB/c品系）是最常用的動物模型，主要因其疾病模型豐富且所需化合物量少（通常僅需1-3mg）。

大鼠（如Sprague–Dawley和Wistar）則常用于劑量探索研究，作為中間模型。

食蟹猴是主要的非嚙齒類動物模型，被70%的公司采用，原因在于其與人類具有超過85%的靶序列同源性，且核酸酶表達模式相似。

在組織采樣方面：血清或全血是最常采集的基質（90%的公司）；肝臟次之（80%），因其是寡核苷酸藥物的主要蓄積和代謝器官；腎臟也被廣泛采樣（60%），作為關鍵清除途徑之一；肌肉和脾臟則僅在特定靶點相關項目中被部分公司采集。

生物分析中的歸一化、一致性與檢測技術

為減少實驗變異并確保跨研究數據的一致性，各公司采用多種歸一化策略：50%的公司使用獨立生物標志物或其他內源性分析物進行歸一化；30%采用總蛋白定量；60%使用其他方法，如加入內標或按組織重量歸一化。

這些策略對寡核苷酸項目尤為重要，因為其絕對定量易受基質效應、穩定性差異及細胞攝取不均等因素干擾。

常用組織濃度檢測技術包括：1）qPCR/RT-qPCR/ddPCR（80%）；2）雜交法（hybridization assays，70%）；3）液相色譜-質譜聯用（LC/MS，100%）——因其能特異性識別母體藥物并表征代謝物，已成為行業標配；4）配體結合分析（LBA，50%）；5）免疫熒光成像（20%）；6）放射性標記計數（10%）。

在組織與血漿基質間的方法一致性方面：僅有20%的公司始終使用相同分析方法；其余80%根據基質特性或具體分析需求，采用基質適配（matrix-dependent）或“適用即用”（fit-for-purpose）策略。

盡管方法各異，所有公司均以組織重量對濃度數據進行歸一化。此外，30%的公司還輔以總RNA/DNA含量、看家基因表達水平或外源內標進一步校正。

組織樣本中殘留血液污染的處理

血液殘留可能干擾組織藥物濃度的真實評估，但各公司對此處理方式不一：僅20%的公司始終考慮血液污染問題；40%偶爾考慮；40%完全未處理。

為減少血液干擾，部分公司采用器官灌注：10%常規進行；70%偶爾進行；20%從不進行。

對于不進行灌注的公司，其主要理由是：在組織采集時，系統循環中的藥物濃度已極低，不太可能顯著影響組織水平的解釋。

提取方法驗證與多方法聯用策略

在組織樣本的提取效率與回收率驗證方面，各公司做法差異顯著：77.8%的公司偶爾進行驗證；僅11.1%將其作為標準流程；另有11.1%完全不進行此類驗證。

在開展驗證的公司中，通常遵循標準的生物分析開發流程，包括：方法優化、回收率測試以及跨基質的重現性研究。

關于是否采用多種檢測方法：80%的公司表示有時會結合多種分析技術；20%則僅依賴單一平臺。

在生物分析方法的資格認證（qualification）方面：90%的公司采用“適用即用”（fit-for-purpose）策略，根據具體應用場景定制方法；其中，50%遵循ICH M10指導原則或其他相關監管標準；40%使用未經正式認證的探索性方法；10%將組織勻漿和提取步驟的驗證納入整體方法資格認證體系。

PK/PD建模應用及其對臨床轉化的影響

所有受訪公司均表示，寡核苷酸組織濃度數據在一定程度上用于支持人體劑量預測：100%用于指導轉化PK建模；80%用于構建臨床前PK/PD模型；40%用于輔助解釋毒理或安全性發現。

在建模輸入參數選擇上：80%傾向使用總組織濃度；20%更偏好細胞內結合態濃度（cell-associated concentrations）；此外，30%還采用其他替代指標，如RISC復合物加載量或細胞內蛋白復合物定量。

關于組織濃度數據對預測模型的價值：90%認為其顯著提升了PK/PD模型在臨床轉化中的準確性與相關性；僅10%認為獲益有限，主要受限于數據質量、生物學變異性或模型擬合困難。

在基于PBPK或mPBPK模型開發中：80%的公司偶爾使用組織濃度數據；10%常規使用；10%完全不用。

在模型的實際應用方面：40%間歇性使用PBPK/mPBPK框架；20%常規應用；40%在其ONT項目中未采用PBPK建模。

在安全性評估與關鍵決策中的應用

在將組織濃度數據用于安全性評估方面，業界意見基本持平：50%的公司將這些數據納入安全評價；另外50%則未使用。

在使用該數據的公司中：40%表示組織濃度有助于解釋毒性機制，并指導后續開發決策。

而在未用于安全性評估的公司中：40%認為這些數據非必需或不可獲得；20%對其潛在價值持不確定態度。

綜上，盡管組織濃度數據在PK/PD建模和臨床轉化中已獲廣泛認可，但在安全性評估中的整合仍存在較大分歧，反映出當前行業在數據應用深度和標準化方面的挑戰。

本次調研結果表明，行業在ONTs組織分布評估方面的差異并非源于分析平臺本身——所有受訪公司（100%）均使用LC–MS，而主要體現在實施策略的不一致上。例如：僅50%的公司始終評估體內分布，40%則根據項目需求靈活決定；提取方法驗證方面，78%僅偶爾開展，僅11%將其作為常規流程；高達40%的公司完全未處理組織樣本中的血液殘留污染問題。

這些差異反映出當前ONT研發仍以早期階段項目為主，盡管業界興趣濃厚，但技術挑戰仍在制約臨床推進。因此，亟需在組織采集與處理流程上建立統一標準，以實現更高效的管線整合。

體內分布評估頻率存在差異。評估頻率的不一致，既反映了各公司在資源投入上的權衡，也凸顯了缺乏行業統一實踐標準的問題。那些堅持系統性評估的公司，通常更清楚寡核苷酸藥物血漿PK與組織PK嚴重脫節這一核心特征。

評估頻率隨研發階段動態變化：在先導化合物優化階段達90%（用于篩選理想分布特性）；FIH后降至50%，轉而依賴已建立的PK模型。這體現了從“探索性表征”向“模型驅動決策”的自然演進。

生物分析方法選擇與驗證方面，標準化空間巨大。LC–MS被全行業采用，因其能特異性識別母藥并解析復雜的體內代謝產物。qPCR/RT-qPCR和雜交法作為補充，提供對痕量寡核苷酸的高靈敏度檢測。

驗證實踐差異顯著，“適用即用”策略雖具靈活性，但可能損害跨研究數據的可比性。同時，對血液污染處理不一致（僅10%常規灌注器官）以及驗證流程缺失，均表明亟需建立標準化的生物分析工作流。

PK建模與臨床轉化方面，潛力未充分釋放。所有公司均利用組織濃度數據支持人體劑量預測，承認僅依賴血漿數據外推存在局限。然而，PBPK/mPBPK建模應用率偏低，僅20%常規使用，40%完全未采用。這是一種未被充分利用的機制性工具，尤其適用于非肝靶向或新型遞送系統的ONT。

多數公司偏好使用總組織濃度而非細胞內結合態濃度，雖出于操作便利，但可能無法反映藥理活性部分。RISC加載量等機制性指標使用有限（僅30%），限制了對藥效機制的深入理解。

建議，即使資源有限，也可采用簡化PBPK（mPBPK），聚焦靶器官與清除器官，利用已發表的內吞/溶酶體轉運參數，無需依賴組織活檢，可借助藥效學生物標志物或循環細胞外囊泡作為組織暴露的替代指標。對監管申報而言，PBPK模型能強化藥理學依據，尤其當敏感性分析揭示種屬間受體表達或核酸酶活性差異時，可有力支持劑量選擇。

需要特別提示的是，siRNA在血漿中半衰期極短（<1小時），但組織濃度可持續數周，因此在多數情況下，血液殘留對組織濃度測定影響可忽略，相關污染評估應依化合物特性而定。

另外，在是否將組織濃度數據用于安全性評價上，行業呈現五五開。使用方（50%）認為其有助于解釋毒性機制、計算安全窗。未使用者中，40%稱“不需要或不可得”，20%則“不確定價值”。鑒于寡核苷酸的毒性常出現在高蓄積組織（如肝、腎），組織數據對機制性安全評估至關重要。

值得注意的是，FDA于2024年6月發布的指南（Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry）明確強調需開展全面的體內分布研究，表明監管機構已將基于組織的評估視為必要要求。

引自：Industry Practices in Oligonucleotide Tissue Biodistribution Assessment: An IQ consortium Cross?Industry Survey of Current Approaches and Emerging Trends

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