Nature：一篇「體內CAR-T」重磅論文

CAR-T細胞療法為血癌治療帶來了變革，同時正在自免等疾病領域展現潛力。為提高這類免疫療法的可及性，過去幾年基于慢病毒及LNP-RNA兩大技術路線的體內（in vivo）CAR-T技術飛速發(fā)展，然而前者雖然能實現CAR的持續(xù)表達，但CAR基因會隨機整合到T細胞基因組中（缺乏特異性），后者只能實現短暫的CAR表達，因此持久性有限。

3月18日，最新發(fā)表在Nature雜志上的一篇突破性論文中，來自加州大學舊金山分校（UCSF）等機構的一個科學家團隊提出了一種新型的基因編輯策略，利用雙載體系統(tǒng)（EDV和AAV），在小鼠體內更加精準地生產出了體內CAR-T。

Nyberg等提出了體內CAR-T新策略：a)基因編輯組件被“打包”成了兩部分。其中一部分是編碼CAR的DNA序列，來自T-cell receptor α constant gene的序列（TRAC；同源序列）位于其兩側，這些序列被裝載在AAV病毒中。另一部分包括Cas9蛋白（基因編輯蛋白）和guide RNA（引導Cas9到TRAC處）被封裝在包膜遞送載體（EDV）中。EDV 表面有一種抗體片段，能夠與 T 細胞上的蛋白質 CD3 結合，并且還有一種被稱為 VSV G 的蛋白質的變體，它有助于囊泡與 T 細胞融合。b)將AAV與EDV注射到小鼠中。AAV 與 T 細胞上的蛋白質 CD7 結合。首先，Cas9 會切割 TRAC 基因；其次，由同源序列引導的 DNA 修復過程使得 CAR 序列能夠插入到 TRAC 位點，從而取代 TRAC。CAR表達后使得T細胞能夠識別B細胞上的CD19蛋白。靶點識別會激活CAR-T細胞，從而導致表達 CD19 的細胞死亡。（來源：Nature）

具體來說，研究人員的目標是將 CAR 序列直接插入到編碼部分 T 細胞受體的基因中（即 T-cell receptor α constant gene, TRAC）。要在小鼠體內實現這一目標，需要兩個組成部分來編輯 T 細胞（圖 1a）：一種由 Cas9蛋白和引導 RNA 組成的復合物，它能特異性地在目標位點切割DNA；以及兩側帶有 TRAC 序列的CAR基因（TRAC 同源序列，同源定向修復的模板）。

Cas9 蛋白與引導 RNA 復合物通過一種包膜遞送載體（EDV）進行遞送。這種小型的病毒樣顆粒（VLP）表面有一種能與 CD3 結合的抗體片段，來靶向T 細胞（CD3是僅存在于 T 細胞表面的一種蛋白質）。刺激 CD3 也會誘導T 細胞增殖，從而啟動一種稱為同源定向修復（HDR）的過程（圖 1b）。

此外，研究人員進化出了一種AAV變體，使其能夠避開已存在的針對 AAV 的抗體，然后利用這種新型AAV遞送包含CAR基因的HDR模板。這種AAV還被證明會優(yōu)先進入 T 細胞，這是因為其與 CD7 蛋白發(fā)生了相互作用。CD7 是 T 細胞以及NK細胞所特有的表面蛋白。這一過程導致了CAR編碼序列特異性插入到TRAC 基因中。

對基因編輯及CAR表達特異性的研究顯示，CAR序列的插入和表達僅發(fā)生在CD4 和CD8 T 細胞，在其他測試的細胞中幾乎未見這種插入現象。

進一步的研究顯示，在植入了人類免疫細胞（包括T細胞和B細胞）的免疫功能缺陷的小鼠中，EDV及AAV給藥成功地將 CAR 序列引入了T 細胞中，使它們能夠識別 B 細胞表面的 CD19 蛋白。在接受治療后的兩周內，這些CAR-T 細胞的數量增加，占 T 細胞總數的比例達到了顯著的 5%至20%。它們的功能性通過對表達CD19的B細胞的同步清除得到了證明。

對經過工程改造的 T 細胞的進一步分析表明，CD4 和 CD8 兩個亞群均被編輯，且這些細胞均顯示增殖和激活標志物，同時仍保持干細胞樣特性。這些特性將有利于工程化細胞的長期存活，并使 CAR-T 細胞能夠發(fā)揮抵御疾病復發(fā)的作用。

接著，科學家們證實，這種創(chuàng)新體內CAR-T策略在治療B 細胞白血病小鼠模型方面是有效的。基于EDV及AAV的體內CAR-T策略治愈了所有白血病小鼠，而其他方法產生的CAR-T細胞（包括基于慢病毒生成的體內CAR-T細胞）在測試劑量下未能達到同樣的效果。

最后，研究人員還證實，他們的新方法能夠遞送靶向其他類型癌癥（如骨髓瘤和肉瘤）的CAR 序列（在接受治療的小鼠中，多發(fā)性骨髓瘤也被完全清除，超過一半的肉瘤小鼠完全緩解），甚至還證明了能夠形成針對腫瘤的持久免疫記憶的能力。

對于接下來的臨床開發(fā)，Nature配發(fā)的一篇觀點文章指出，一方面要進一步確定該創(chuàng)新策略的靶向性（深入研究脫靶編輯情況，包括是否編輯了其他細胞類型，以及是否CAR序列插入到非目標位點），另一方面，要在能夠反映免疫失調情況（這是癌癥的一個顯著特征）的模型中對這種方法進行測試（健康的T細胞不能代表癌癥患者的T細胞狀態(tài)）。

來源：Azalea Therapeutics

值得一提的是，領導該研究的免疫學家Justin Eyquem已經與CRISPR技術先驅、諾獎得主Jennifer Doudna（Nature論文共同作者）等人聯(lián)合創(chuàng)辦了一家名為Azalea Therapeutics的公司，該公司去年11月宣布完成8200萬美元的種子輪和A輪融資，目前正在猴子身上測試這一新方法，并希望能在明年年底前開展人體臨床試驗。

參考資料：

[1]https://www.nature.com/articles/s41586-026-10235-x

[2]https://www.ucsf.edu/news/2026/03/431616/scientists-create-cancer-fighting-immune-cells-right-body

[3]https://www.nature.com/articles/d41586-026-00634-5

[4]https://www.nature.com/articles/d41586-026-00857-6

[5]https://www.globenewswire.com/news-release/2025/11/04/3180290/0/en/Azalea-Therapeutics-Launches-with-82-Million-Financing-to-Redefine-Precision-Genomic-Medicines-by-Engineering-Cells-Directly-Inside-Each-Patient.html

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