Life?Metabolism?|?John R Speakman團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)短期熱量限制激活跨組織選擇性剪接程序，揭示抗衰新機(jī)制

衰老是多種慢性疾病（如2型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和癌癥等）的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。熱量限制（Calorie Restriction, CR）作為一種非遺傳干預(yù)手段，已被廣泛證實(shí)能夠延緩衰老過程，延長健康壽命，但其分子機(jī)制尚未完全闡明。選擇性剪接（Alternative Splicing, AS）作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在衰老過程中出現(xiàn)失調(diào)，但在CR后這種失調(diào)有所減輕，這表明AS在CR的有益效應(yīng)中起著重要作用。但CR引發(fā)的AS響應(yīng)是否具有組織特異性，以及AS響應(yīng)是否與CR水平成比例仍不甚清楚。這個(gè)問題的解決可能解釋CR的系統(tǒng)性抗衰老效應(yīng)。

近日，John R. Speakman研究團(tuán)隊(duì)在Life Metabolism期刊發(fā)表題為A functionally integrated cross-tissue alternative splicingprogram during short-term calorie restriction的研究論文，通過整合既往小鼠多組織RNA-seq資源，并新增肌肉與睪丸測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了六組織梯度CR轉(zhuǎn)錄組用于系統(tǒng)性剪接分析，系統(tǒng)描繪了短期CR引發(fā)的AS圖譜，提出“位點(diǎn)組織特異、功能跨組織整合”的剪接響應(yīng)框架，為理解CR的抗衰老作用提供了新視角。

該研究利用48只雄性C57BL/6小鼠模型進(jìn)行為期3個(gè)月的梯度CR（0%-40%，以10%遞增），并設(shè)置12小時(shí)自由進(jìn)食對(duì)照組（12AL），隨后采集6種組織（包括白色脂肪組織（eWAT）、肝臟、下丘腦、肌肉、睪丸和胃）的RNA-seq數(shù)據(jù)。通過比較CR組與12小時(shí)自由進(jìn)食對(duì)照組（12AL），系統(tǒng)分析了基因表達(dá)和AS的變化。

研究首先分析了全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)對(duì)梯度CR的響應(yīng)。結(jié)果顯示，除睪丸和下丘腦外，其他組織的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes, DEGs）數(shù)量隨CR水平升高而增加。其中，eWAT的DEGs最多（4126個(gè)），其次是肌肉（1982個(gè)）和肝臟（1883個(gè)），而睪丸、下丘腦和胃的響應(yīng)較弱。這些趨勢通過差異基因表達(dá)分析可視化，提示短期CR對(duì)代謝活躍的外周組織（脂肪、骨骼肌、肝臟）的轉(zhuǎn)錄重塑更為顯著。

值得注意的是，40% CR時(shí)僅有兩個(gè)基因（H2-Aa和H2-Eb1，均為MHC II相關(guān)基因）在所有6種組織中呈現(xiàn)一致性的表達(dá)下調(diào)，這提示CR可能通過抑制年齡相關(guān)的炎癥/免疫通路發(fā)揮益處。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄因子富集分析表明，CR調(diào)控了脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和免疫相關(guān)通路，且這些響應(yīng)具有組織特異性。例如，PPAR-α靶基因在肌肉、睪丸、肝臟和eWAT中上調(diào)，而炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Jun和SMAD家族）在eWAT中顯著下調(diào)。

剪接調(diào)節(jié)因子（splicing regulators, SRs）負(fù)責(zé)調(diào)控AS過程，通過結(jié)合pre-mRNA的特定順式作用元件（如外顯子增強(qiáng)子或沉默子），調(diào)控剪接體的組裝和剪接位點(diǎn)的選擇，影響基因表達(dá)。SRs表達(dá)分析顯示，SRs差異表達(dá)數(shù)量隨CR程度升高而增加，且主要集中在肌肉、eWAT和肝臟，其中少數(shù)SRs呈跨組織一致變化，例如冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白R(shí)bm3在4種組織上調(diào)，提示CR可能通過影響體溫/應(yīng)激相關(guān)通路，啟動(dòng)更廣泛的剪接重塑。

AS分析是本文的核心。研究發(fā)現(xiàn)CR導(dǎo)致的差異剪接（differential AS, DAS）和差異轉(zhuǎn)錄本使用（differential transcript usage, DTU）事件隨CR程度升高而顯著增加。肌肉、eWAT和肝臟的AS響應(yīng)最為顯著；值得注意的是，睪丸盡管基因表達(dá)變化較小，卻表現(xiàn)出強(qiáng)烈的AS響應(yīng)，提示AS在睪丸中可能具有獨(dú)特作用。重要的是，94%的DAS基因位點(diǎn)并不伴隨基因?qū)用娴牟町惐磉_(dá)，表明AS在很大程度上是獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的CR響應(yīng)機(jī)制。DAS和DTU分析進(jìn)一步量化了這些變化，顯示各組織在不同CR水平下的異構(gòu)體使用模式。然而，DAS與DEGs的重疊程度高于隨機(jī)預(yù)期，提示轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后過程存在協(xié)同調(diào)控。功能富集分析顯示，不同組織中被AS重塑的具體位點(diǎn)差異很大，但富集的生物過程高度一致，主要指向線粒體功能與氧化磷酸化、轉(zhuǎn)錄翻譯、RNA和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制以及細(xì)胞死亡/自噬等衰老相關(guān)環(huán)節(jié)等過程，這些功能在多個(gè)組織中共享，體現(xiàn)了AS響應(yīng)的功能整合性。

盡管AS響應(yīng)以組織特異性為主，但研究仍然鑒定出一組跨組織共享的AS位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能介導(dǎo)CR的系統(tǒng)性效應(yīng)。例如，Gna13與Nfe2l2在多組織中呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本切換，分別關(guān)聯(lián)GPCR信號(hào)與抗氧化/應(yīng)激調(diào)控。此外，參與內(nèi)體分選與細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）生物發(fā)生的Pdcd6ip與Arrdc4也出現(xiàn)跨組織剪接變化，提示CR可能通過“剪接—囊泡—細(xì)胞間通訊”軸影響衰老相關(guān)表型。這些共享位點(diǎn)提示CR可能通過調(diào)控細(xì)胞間通訊延緩衰老，為后續(xù)機(jī)制研究提供了靶點(diǎn)。

該研究的發(fā)現(xiàn)支持了“AS失調(diào)是衰老標(biāo)志之一，而CR可逆轉(zhuǎn)這一過程”的假設(shè)。AS響應(yīng)與CR水平的劑量依賴性關(guān)系，暗示AS是CR改善健康壽命的關(guān)鍵介質(zhì)。尤其值得注意的是，SRs的表達(dá)變化與AS響應(yīng)一致，如冷誘導(dǎo)蛋白R(shí)bm3在四個(gè)組織中上調(diào)，可能與CR相關(guān)的體溫下降機(jī)制聯(lián)動(dòng)。需要強(qiáng)調(diào)的是，這項(xiàng)研究尚未進(jìn)行功能性的因果性驗(yàn)證。同時(shí)，作者也提出若干技術(shù)與設(shè)計(jì)局限，如測序讀長與深度在不同組織間不一致，樣本量相對(duì)有限，且僅使用雄性小鼠并采用3個(gè)月短期CR。未來可采用長讀長測序或事件級(jí)AS分析提高異構(gòu)體分辨率，同時(shí)納入雌性與更長期的CR模型，以及圍繞跨組織共享位點(diǎn)（如Gna13、Nfe2l2、EV相關(guān)基因）開展遺傳、藥理學(xué)干預(yù)以檢驗(yàn)其對(duì)健康壽命指標(biāo)的因果貢獻(xiàn)。

綜上所述，該研究系統(tǒng)描繪了短期CR誘導(dǎo)的AS圖譜，強(qiáng)調(diào)AS作為獨(dú)立于基因表達(dá)的抗衰老機(jī)制，通過整合多組織數(shù)據(jù)，揭示了AS在代謝重塑、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞通訊中的核心作用，為開發(fā)模擬CR效應(yīng)的藥物提供了新靶點(diǎn)。

原文：https://doi.org/10.1093/lifemeta/loaf046

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