Mol Cell?|?Restrictor通過識別序列特異性RNA介導基因外DNA的轉錄終止

撰文 | 格格

哺乳動物基因組中廣泛存在基因間區轉錄現象，但基因的轉錄輸出量遠高于基因間區，提示細胞存在主動限制基因外轉錄的調控機制【1, 2】。近年來發現的Restrictor復合物（由WDR82和RNA結合蛋白ZC3H4組成）能夠特異性終止基因間區轉錄，而對蛋白編碼基因影響有限，其缺失會導致基因間區RNA Pol II獲得異常持續合成能力，產生大量本應被抑制的lncRNA【3】。然而，Restrictor如何特異性識別并終止基因間區轉錄的分子機制尚不清楚：是WDR82的染色質招募決定了靶標特異性，還是ZC3H4通過RNA序列識別介導選擇性終止？盡管早期在果蠅中發現ZC3H4同源蛋白Su(s)可序列特異性結合RNA基序，但該機制在哺乳動物中是否保守、以及Restrictor兩個亞基如何分工實現靶標選擇性，一直是領域內未解決的核心科學問題。

近日 ， 來自 意大利歐洲腫瘤研究所 的Gioacchino Natoli研究團隊在Molecular Cell雜志發表題為Sequence-specific RNA recognition drives Restrictor-mediated termination of extragenic transcription的研究論文，這項研究旨在解析Restrictor復合物特異性終止基因間區轉錄的分子機制，發現了WDR82負責將Restrictor招募至活躍轉錄位點但不提供靶標特異性，而ZC3H4通過其C3H1型鋅指結構域特異性識別基因間區轉錄本5'端富集的RNA序列基序（與果蠅中報道的基序高度相似），從而介導選擇性轉錄終止，揭示了Restrictor通過“WDR82介導招募、ZC3H4識別RNA”的雙重機制實現靶標特異性的工作原理。

首先，研究人員通過CRISPR-Cas9技術在HeLa細胞中敲除了ZC3H4蛋白的C3H1型鋅指結構域和SRG結構域。他們使用超分辨率顯微鏡和4sU-seq技術評估了這些突變對基因 外DNA 轉錄的影響。結果顯示，敲除C3H1鋅指或SRG結構域均導致基因 外DNA 轉錄無法被有效抑制，表明這兩個結構域在Restrictor活性中發揮重要作用。

接著，研究人員使用RNA Bind-n-Seq (RBNS) 技術研究了ZC3H4的C3H1鋅指的RNA結合特異性。他們構建了一個隨機RNA庫，并與不同濃度的ZC3H4-C3H1蛋白混合。通過高通量測序分析發現，ZC3H4-C3H1鋅指特異性地結合富含GUA重復序列的RNA片段。進一步分析表明，ZC3H4-C3H1鋅指與WDR82互作的結構域并不影響其RNA結合特異性。 研究人員 進一步分析ZC3H4 RNA結合基序在基因組中的分布發現，與編碼基因相比，ZC3H4 RNA結合基序在基因 外DNA 轉錄起始位點附近富集，特別是那些被Restrictor抑制的非編碼轉錄本，表明ZC3H4的RNA結合活性與基因 外DNA 轉錄調控密切相關。

為驗證ZC3H4與靶RNA的直接相互作用，研究人員使用增強型交聯和免疫沉淀 (eCLIP) 技術分析了ZC3H4在HCT116細胞中的結合位點。結果顯示，ZC3H4與大量非編碼轉錄本的5'端結合，且與4sU-seq和ChIP-seq數據一致。此外，eCLIP分析還發現ZC3H4結合的RNA片段與轉錄抑制相關，進一步證實其RNA結合活性與轉錄調控功能有關。

為全面了解Restrictor的活性范圍，研究人員使用DRB暫停RNA Pol II的延伸，并在DRB釋放后檢測ZC3H4的結合位點。結果顯示，DRB釋放后ZC3H4的結合位點數量和信號強度顯著增加，表明Restrictor對基因 外DNA 轉錄的抑制具有更廣泛的活性范圍。

最后，通過遺傳互補實驗分析ZC3H4不同結構域的功能，結果顯示C3H1鋅指、SRG結構域和WDR82互作結構域對基因 外DNA 轉錄調控都至關重要。其中，WDR82互作結構域負責將Restrictor招募至轉錄起始位點，而C3H1鋅指和SRG結構域則參與靶RNA的序列特異性識別。

圖1 序列特異性RNA識別驅動Restrictor介導的基因外轉錄終止

總之， 該研究發現ZC3H4的C3H1通過序列特異性RNA結合識別基因 外DNA 轉錄本，從而介導Restrictor對基因 外DNA 轉錄的選擇性抑制，為理解基因調控的復雜機制提供了新的見解 。

https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(26)00101-2

制版人： 十一

參考文獻

1. Almada, A.E., Wu, X., Kriz, A.J., Burge, C.B., and Sharp, P.A. (2013). Promoter directionality is controlled by U1 snRNP and polyadenylation signals.Nature499, 360–363.

2. Field, A., and Adelman, K. (2020). Evaluating Enhancer Function and Transcription.Annu. Rev. Biochem.89, 213–234.

3. Austenaa, L.M.I., Piccolo, V., Russo, M., Prosperini, E., Polletti, S., Polizzese, D., Ghisletti, S., Barozzi, I., Diaferia, G.R., and Natoli, G. (2021). A first exon termination checkpoint preferentially suppresses extragenic transcription.Nat. Struct. Mol. Biol.28, 337–346.

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