Blood | 逯丹/麥鴻成/徐安定團隊破譯免疫血栓新概念，開辟半暗帶救治新路徑

血栓的組成對急性缺血性卒中（ AIS ）的臨床結(jié)局具有決定性影響。在 AIS 發(fā)病后，梗死核心周圍存在一片尚未不可逆死亡的腦組織 —— 缺血半暗帶，其能否被及時挽救直接決定患者的最終神經(jīng)功能預(yù)后。而高硬度血栓往往對機械取栓和藥物溶栓產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致血管再通延遲甚至失敗，使半暗帶在時間窗內(nèi)無法獲得再灌注，最終演變?yōu)椴豢赡婀Ｋ馈Ｏ噍^之下，較軟的血栓對治療反應(yīng)更佳，有利于實現(xiàn)早期完全再通、最大限度地挽救半暗帶。因此，理解決定血栓硬度的細胞與分子因素，是拓展有效治療時間窗、保護缺血半暗帶的關(guān)鍵科學(xué)問題。

組織病理學(xué)研究顯示，血栓由紅細胞、血小板、纖維蛋白及多種免疫細胞構(gòu)成，其中中性粒細胞已被公認為動脈血栓形成的重要參與者。越來越多的證據(jù)表明，中性粒細胞在動脈血栓內(nèi)的浸潤程度隨時間推移而增加，降低血運重建效率，并與不良臨床結(jié)局相關(guān)。除經(jīng)典的炎癥功能外，中性粒細胞還被發(fā)現(xiàn)參與膠原合成與細胞外基質(zhì)重塑，提示其可能主動影響血栓的結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)特性。然而，這一假說迄今缺乏系統(tǒng)的空間分子學(xué)證據(jù)。

近日，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 逯丹 研究員 / 徐安定 教授團隊聯(lián)合中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院 麥鴻成 副研究員，在國際血液學(xué) 期刊Blood上在線發(fā)表了題為：Pathogenic Role of SERPINB3-positive Neutrophils in Reinforcing Thrombus Stiffening during Ischemic Stroke的研究論文，整合三維空間成像、多重免疫熒光標記與激光顯微切割空間蛋白質(zhì)組學(xué)，在AIS取栓血栓中系統(tǒng)繪制了免疫細胞的空間圖譜，鑒定出驅(qū)動血栓硬化的關(guān)鍵分子軸——SERPINB3-TGFβ1-COL1A1信號通路，并證明靶向SERPINB3可有效提升溶栓效率、延長有效再灌注時間窗，為缺血半暗帶的保護與挽救提供了全新的分子靶點和治療策略

研究團隊對 AIS 患者取栓后即刻獲取的新鮮血栓進行組織透明化處理，結(jié)合三維空間成像技術(shù)，首次實現(xiàn)了人類卒中血栓內(nèi)免疫細胞與結(jié)構(gòu)成分的全景立體可視化。快速綠染色清晰勾勒出包裹血栓的致密膠原外殼，而殼內(nèi)主要由有核細胞（ PI+ ）填充，揭示膠原沉積與細胞分布之間的空間對應(yīng)關(guān)系。

進一步采用高通量循環(huán)免疫熒光標記技術(shù)（ MICS ），研究者對中性粒細胞（ MPO+ ）、白細胞（ CD45+ ）、 B 細胞（ CD20+ ）、 T 細胞（ CD8+ ）、 M2 型巨噬細胞（ CD163+ ）、成纖維細胞樣細胞（ vimentin+ ）、內(nèi)皮細胞（ CD31+ ）、趨化因子受體（ CD183+ ）等多種細胞類型進行原位高分辨率同步定位，構(gòu)建了迄今最為詳細的 AIS 血栓免疫微環(huán)境圖譜（數(shù)據(jù)已公開： https://thrombus-atlas.ludanlab.org/ ）。空間分析結(jié)果顯示，中性粒細胞（ MPO+ ）是血栓內(nèi)豐度最高的免疫細胞群，其次為 vimentin+ 成纖維細胞樣細胞。三維成像進一步證實， Ly6G+ 中性粒細胞集中分布于對應(yīng)膠原富集區(qū)域的血栓外周層。

對不同時間點（ 3 小時、 8 小時、 16 小時）取栓血栓進行免疫組化與 Masson 三色染色，結(jié)果顯示中性粒細胞富集區(qū)域與膠原密集區(qū)域持續(xù)共定位，且膠原沉積隨時間進行性增加。對卒中后 3 小時至 60 天系列時間點的血栓分析還發(fā)現(xiàn)， MPO+ 中性粒細胞水平在急性期顯著升高，而 TGFβ1 （ p<0.05 ）與 FSP1 （ p<0.01 ）表達隨時間依次增加，提示中性粒細胞通過 TGFβ1 相關(guān)通路驅(qū)動血栓纖維化是一個協(xié)調(diào)進行的時序過程。

對 19 例取栓血栓進行的相關(guān)性分析證實， COL1A1+/MPO+ 細胞比例（ Spearman R=0.648 ， p<0.001 ）與 AFM 測定的血栓硬度（ Spearman R=0.634 ， p<0.001 ）均與患者 90 天 mRS 評分顯著正相關(guān)，表明中性粒細胞相關(guān)膠原沉積與血栓硬度是不良長期功能結(jié)局的重要驅(qū)動因素。

在 FeCl ? 誘導(dǎo)的小鼠頸動脈血栓模型中，免疫熒光分析顯示 MPO+ 中性粒細胞浸潤與 COL1A1 沉積在急性期（ 1 至 24 小時）同步增加，峰值出現(xiàn)于 24 小時，此后逐漸下降。值得注意的是，在體外人工血栓模型中，中性粒細胞（ MPO+ ）早在血栓形成 15 分鐘即可檢出 COL1A1 陽性信號，而其他細胞類型（ α-SMA+ 細胞、 MPO?CD45+ 白細胞、 CD235a+ 紅細胞、 CD62p+ 活化血小板）均僅顯示極低背景信號，提示中性粒細胞是早期膠原沉積最主要的來源細胞。 TGFβ1 和 FSP1 在此后進行性升高并向血栓外周局聚集，提示時序化的激活與空間組織過程正在發(fā)生。

AFM 分析描繪了血栓力學(xué)演變的完整時程：早期血栓（ 1 小時）呈均勻的軟纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)； 12 至 24 小時出現(xiàn)軟硬交替的異質(zhì)性基質(zhì)； 3 至 14 天達到峰值硬度并伴有致密膠原沉積，與纖維化重塑一致； 28 天后硬度下降，提示基質(zhì)降解與血栓軟化。這一力學(xué)演變進程與 MPO 和 COL1A1 表達的時程變化高度吻合。

利用抗 Ly6G 抗體清除循環(huán)中性粒細胞后， FeCl ? 誘導(dǎo)的頸動脈血流下降 50% 的時間從對照組的約 250±45 秒延長至約 370±70 秒，血栓體積顯著減小，且 AFM 分析顯示血栓硬度顯著降低（ p<0.05 ）。

骨髓嵌合模型進一步從因果層面證實了中性粒細胞的作用：中性粒細胞缺失小鼠頸動脈血流下降 50% 需約 1740±104 秒，而回輸 32Dcl3 來源的成熟中性粒細胞樣細胞（ 32Dcl3-NeuWT ， CD11b+/MPO+ 約占 90% ）后，該時間顯著縮短至約 315±30 秒； 32Dcl3-NeuWT 重建小鼠血栓纖維網(wǎng)絡(luò)更為致密，表面硬度顯著升高。

研究團隊建立了一套基于激光顯微切割（ LCM ）的血栓空間蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程：對血栓冰凍切片進行 MPO 免疫熒光染色后精準分離 MPO+ 中性粒細胞，經(jīng) LC-MS/MS （ timsTOF Pro ， DIA 模式）定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，實現(xiàn)了對血栓內(nèi)特定細胞群的原位蛋白質(zhì)組精細解析。

對 34 例癥狀發(fā)作 24 小時內(nèi)取栓血栓進行分析，樣本按 90 天 mRS 分為預(yù)后良好組（ mRS 0–1 ）與預(yù)后不良組（ mRS 2–6 ），共鑒定 2297 個蛋白質(zhì)，其中 180 個為差異表達蛋白（ |log2FC|≥0.59 ， p<0.05 ），包括 12 個上調(diào)和 168 個下調(diào)蛋白。 GSEA 富集分析顯示，預(yù)后不良組上調(diào)差異蛋白顯著富集于局灶黏附通路（ NES=1.594 ， p=0.001 ）與趨化因子信號通路（ NES=1.530 ， p=0.001 ），均與膠原沉積和血栓硬化密切相關(guān)。

在鑒定出的差異蛋白中， SERPINB3 （絲氨酸蛋白酶抑制劑 B 家族成員 3 ）在預(yù)后不良患者血栓中顯著上調(diào)。 LASSO 回歸分析顯示， SERPINB3 與患者預(yù)后相關(guān)性最強，單獨預(yù)測不良預(yù)后的 ROC 曲線下面積（ AUC ）達 0.806 。多因素 Logistic 回歸進一步證實，血糖（ p=0.033 ）與 SERPINB3 （ p=0.023 ）是 AIS 不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子。 SERPINB3 聯(lián)合臨床因素的綜合模型 AUC 達 0.946 （ 95% CI 0.864–1.000 ），優(yōu)于單純臨床因素模型（ AUC 0.898 ， 95% CI 0.787–1.000 ）。

免疫熒光空間分析顯示， SERPINB3 在血栓內(nèi)的分布與 TGFβ1 及 FSP1 空間高度對應(yīng)，預(yù)后不良患者血栓中 SERPINB3+ 細胞比例顯著更高，且 SERPINB3 陽性細胞比例與 90 天 mRS 評分高度正相關(guān)（ Spearman R=0.877 ， p<0.001 ）。以 22 例患者（預(yù)后良好 11 例、預(yù)后不良 11 例）組成的獨立驗證隊列進一步證實了上述結(jié)論。

為明確 SERPINB3 在血栓形成中的因果作用，研究者在 FeCl ? 誘導(dǎo)頸動脈血栓小鼠中通過 siRNA 靶向敲低 Serpinb3a 。結(jié)果顯示， si-SERPINB3 組頸動脈血流下降 50% 的時間從對照組的 200±72 秒顯著延長至 320±90 秒，且凝血參數(shù)（ PT 、 APTT 、 TT 、纖維蛋白原）無明顯變化，組織學(xué)檢查確認 siRNA 未造成主要器官損傷，驗證了干預(yù)的靶向性與安全性。

在聯(lián)合 MCAO 與 FeCl ? 誘導(dǎo)血栓的卒中模型中， si-SERPINB3 組腦血流下降 50% 的時間（ 768±60 秒）顯著長于對照組（ 510±80 秒）。聯(lián)合 rt-PA 溶栓治療后， si-SERPINB3 組 30 分鐘再灌注血流（基線的 43.8%±17.6% ）顯著優(yōu)于對照組（ 28.2%±6.5% ）， 3 小時完全再通率亦更高（ 75.2%±10.1% vs 47%±7.1% ）。更為重要的是，更快、更充分的再灌注意味著缺血半暗帶獲得了更及時的血流恢復(fù) ——MRI/MRA 分析顯示第 3 天梗死體積顯著減小（ 1.423±1.105 mm3 vs 5.233±1.206 mm3 ），第 7 天神經(jīng)功能評分（ mNSS ）明顯改善，提示 si-SERPINB3 處理有效遏制了半暗帶向梗死核心的演變，實現(xiàn)了對瀕危腦組織的保護。全程未觀察到出血并發(fā)癥， 7 天血流動力學(xué)完全恢復(fù)，安全性良好。

骨髓嵌合模型（ 32Dcl3-Neu NC vs 32Dcl3-Neu Serpinb3aKD ）從遺傳水平進一步驗證：在頸動脈模型中， 32Dcl3- Neu NC 組血流 50% 下降時間約 300±60 秒，而 2Dcl3-Neu Serpinb3aKD 組延遲至 560±34 秒；在 MCAO 模型中分別為 315±150 秒和 855±360 秒。 MRI 顯示，與 32Dcl3-Neu N 組（梗死體積 19.78±5.45 mm3 ）相比， 32Dcl3-Neu Serpinb3aKD 組梗死體積顯著減小（ 11.1±3.94 mm3 ），第 3 天神經(jīng)功能評分同步改善，表明 SERPINB3 功能缺失的中性粒細胞所誘導(dǎo)的血栓硬度降低和再灌注改善，有效縮小了梗死核心、保護了缺血半暗帶內(nèi)尚存活的神經(jīng)元。

利用 CRISPR-Cas9 構(gòu)建的 Serpinb3a 基因敲除小鼠（ Serpinb3aKO ）進行的救援實驗進一步闡明了機制層次：回輸功能正常的 32Dcl3-Neu NC 中性粒細胞可完全恢復(fù)血栓形成與血管閉塞能力；而回輸 SERPINB3 敲低中性粒細胞（ 32Dcl3-Neu Serpinb3aKD ）或經(jīng) TGFβ1 抑制劑 Metelimumab 預(yù)處理的中性粒細胞（ 32Dcl3-Neu WT+Met ）均可顯著延遲血管閉塞并將血栓硬度降至相近水平，提示 TGFβ1 信號是 SERPINB3 下游的關(guān)鍵效 應(yīng)節(jié)點。腦組織切片分析還顯示， 32Dcl3-Neu NC 組缺血腦區(qū) COL1A1+/TGFβ1+ 中性粒細胞更多，周圍 TUNEL+ 凋亡細胞比例更高，而 32Dcl3-Neu Serpinb3aKD 組上述現(xiàn)象顯著減輕，提示 SERPINB3 介導(dǎo)的中性粒細胞活化不僅加重血栓硬化、阻礙再灌注，還直接促進缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡，加速半暗帶向不可逆梗死 組織 的轉(zhuǎn)化。

在 HL-60 來源的中性粒細胞樣細胞氧化應(yīng)激模型（ 100 μM TBHP 刺激）中， Western blot 分析顯示 SERPINB3 、 TGFβ1 、 CitH3 （ NETs 標志物）及 COL1A1 隨刺激時間依次呈時間依賴性上調(diào)。 NETs 降解實驗表明， DNase I 處理可降低 CitH3 水平，但不影響 SERPINB3 表達；而聯(lián)合 si-SERPINB3 處理則同時抑制 CitH3 ，提示 SERPINB3 位于 NETs 信號通路的上游。

給予重組 SERPINB3 蛋白（ rSERPINB3 ）處理可上調(diào) COL1A1 、 TGFβ1 和 CitH3 的表達，上述效應(yīng)可被 SERPINB3 敲低或 TGFβ1 抑制劑 Metelimumab 所逆轉(zhuǎn)，表明 SERPINB3 主要經(jīng) TGFβ1 依賴性通路促進膠原產(chǎn)生和 NET 形成。

在以健康供者外周血建立的體外人工血栓模型中， SERPINB3 mRNA 在血栓形成 3 小時后高度富集于中性粒細胞而非非中性粒細胞組分。激光散斑成像顯示，補充中性粒細胞可加速凝塊形成，經(jīng) rSERPINB3 預(yù)處理進一步加速這一過程，而 TGFβ1 抑制劑 Metelimumab 顯著抑制血凝塊的形成。 AFM 和免疫熒光分析進一步證實， rSERPINB3 預(yù)處理顯著增加血栓硬度與 COL1A1 沉積， TGFβ1 抑制則逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。體內(nèi)骨髓嵌合實驗同樣驗證， SERPINB3 敲低或 TGFβ1 抑制均可改善血栓順應(yīng)性、降低硬度并減少 TGFβ1/CitH3/COL1A1 的表達。

本研究構(gòu)建了一套整合血栓全景三維成像、多重免疫熒光和激光顯微切割空間蛋白質(zhì)組學(xué)的方法學(xué)平臺，系統(tǒng)解析了 AIS 取栓血栓的免疫與力學(xué)微環(huán)境。該研究揭示，中性粒細胞是 AIS 血栓內(nèi)最主要的免疫細胞群，通過 SERPINB3-TGFβ1-NETs-COL1A1 信號軸驅(qū)動血栓進行性硬化，其浸潤密度與血栓硬度均與患者 90 天不良預(yù)后顯著相關(guān)。

在治療層面，靶向抑制 SERPINB3 不僅可延緩血管閉塞、顯著增強 rt-PA 溶栓效率，還通過延長有效再灌注時間窗，為缺血半暗帶爭取到寶貴的血流恢復(fù)機會，從而 縮小梗死核心、保護 缺血半暗帶 瀕危神經(jīng)元，展現(xiàn)出良好的安全性與轉(zhuǎn)化潛力。這些發(fā)現(xiàn)從力學(xué)生物學(xué)視角重新界定了中性粒細胞在卒中血栓中的功能角色 —— 從經(jīng)典的炎癥效應(yīng)細胞擴展為血栓力學(xué)微環(huán)境與半暗帶命運的主動調(diào)控者。靶向 SERPINB3 不僅有望成為預(yù)測 AIS 預(yù)后的新型血栓微環(huán)境生物標志物，更為攻克溶栓抵抗、拓展半暗帶挽救時間窗這一卒中治療的核心難題提供了新的分子切入點。

暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院為本研究的第一完成單位。 臧健坤 博士后（佛山市第一人民醫(yī)院）、 路愛軍 博士后、 楊冰 博士、 譚娜 博士、 劉其煥 碩士、 韋麗萍 博士為本論文共同第一作者。 逯丹 研究員、 徐安定 教授及 麥鴻成 副研究員（合作單位：中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院）為本論文通訊作者。

原文鏈接https://ashpublications.org/blood/article/doi/10.1182/blood.2025029516/566906/Pathogenic-Role-of-SERPINB3-positive-Neutrophils

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